Ⅳ酶的提取与分离纯化

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1、Ⅳ酶的提取与分离纯化重点一酶的下游加工流程1.预处理2.细胞过滤分离3.酶提取4.酶分离纯化5.酶浓缩、结晶、干燥6.酶保存7.酶制剂成型※酶工程下游技术操作条件二预处理1.加热：使温度达到最适温度2.凝聚，絮凝3.加酸碱：达到最适PH三细胞过滤分离1.细胞破碎法⑴机械破碎法：研磨、搅拌、匀浆⑵物理破碎法：温度差法、压力差法、超声波空穴效应⑶化学破碎法：酸碱，有机溶剂破坏细胞壁、膜⑷酶破碎法：加酶破坏细胞壁、膜；最适条件培养，使溶酶体破裂自溶2.过滤方法：加压、常压、减压过滤法※空穴效应：超声波使发酵液中产生许多小气泡，气泡破裂产生内爆力使细胞破碎四酶提取1.本质：使胞内酶溶解到发酵液中，使

2、酶出细胞2.方法：盐溶法，有机溶剂溶解法，PH远离PI3.条件：T：0oC-10oCPH：酶活力范围内，远离PI提取液体积：酶液体积的2-5倍※酶工程下游技术操作条件T：0-10oC低温PH：根据要求,远离或趋近PI加酶活保护剂：有机溶剂提取、沉淀分离时防酶失活五酶的分离纯化沉淀分离膜分离离心分离层析分离电泳分离等电点分离㈠沉淀分离一盐析法1.原理:高浓度(NH4)2SO4中和蛋白质表面电荷,使同电相斥作用减小凝聚沉淀2.二等电点法沉淀分离1.原理:PH=PI时,带电量为零,同电相斥作用最小,凝聚沉淀2.注意：等电点法不破坏水膜，不一定沉淀，须与其他方法联合使用三有机溶剂沉淀法1.原理:有机

3、溶剂破坏蛋白质三级结构,使非极性基团外露,极性基团内藏,使水膜破坏,凝聚沉淀.㈡膜分离法一压差膜法1.纳滤：2.微滤：3.超滤：二电位差膜法（电渗法）1.定义：用两块膜把水槽分为三个室，加空间电场，使中间室中待分离液中正、负离子分别电渗到两边的两室2.注意：正离子向靠近负极的室电渗负离子向靠近正极的室电渗三扩散膜法1.定义：将待分离液装入膜袋中，膜袋外为浓度大于或小于待分离液的溶液。利用浓度差使待分离液中水、杂质通过渗透或渗析而与需要的组分分离2.渗透与渗析⑴渗透：只有溶剂透过膜⑵渗析：有溶质透过膜四膜的选择1.透水率：2.截留率：3.截留物相对分子量：㈢离心分离一离心机的选择1.常速离心机

4、：Vmax≤8000r/min；用于：2.高速离心机：Vmax≤（1-2.5）×104r/min；用于：3.超速离心机：Vmax＝（2.5-12）×104r/min；用于：生物大分子、二离心方法1.差速离心法：利用密度（质量数）不同的物质离心速度不同而分离密度大的物质在离心瓶底部，密度小的在上部2.密度梯度离心法：3.等密度离心法：㈣层析分离一吸附层析1.原理：利用各物质在同种吸附剂中扩散速度不同而分离2.常用吸附剂：二分配层析1.原理：利用吸附剂与载体的共同作用，各物质扩散速度不同而分离，比吸附层析效果好2.三类：⑴滤纸层析⑵⑶三离子交换层析1.原理：利用离子交换剂上柱，以离子键与待分离物

5、结合，再水洗掉杂质，洗脱剂洗脱待分离物，从而得到待分离物，离子键结合稳，效果好2.几个重要的离子交换剂：3.几个重要的洗脱剂：※离子交换剂：阴离子交换剂：带正电的物质，可吸附阴离子阳离子交换剂：带负电的物质，可吸附阳离子※层析基本操作过程层析柱的准备固定相材料的准备装柱平衡上样（洗涤和）洗脱收集洗脱液洗脱液检测，绘制洗脱曲线（柱再生）四凝胶层析1.原理：待分离液与凝胶溶液混合上柱，利用大分子太大，不从凝胶网孔通过，而是从凝胶粒子间通过，受阻力小，沉降快，而小分子小，可从凝胶网孔通过，在凝胶中受阻力大，沉降慢而分离分子大小差距大的物质2.几种常用凝胶：五亲和层析1.原理：固定相上柱成母体，再用

6、母体活化剂为母体引入活泼基团，使母体以共价键与待分离物结合，再水洗、洗脱得待分离物，母体与待分离物结合稳，效果好2.固定相：3.母体活化剂：※母体：上柱的载体配体：待分离物固定相：同母体※亲和层析操作过程固定相选择固定相活化层析过程层析柱的准备固定相材料的准备装柱平衡上样（洗涤和）洗脱收集洗脱液洗脱液检测，绘制洗脱曲线（柱再生）下一轮上样㈤电泳分离※原理电泳速率只与Q、r有关（电荷效应、分子筛效应），而Q与PH有关（PH趋近PI时Q最小，反之同理），r与M有关（M大则r大，反之同理）※支持物要求均匀、阻力小※电泳方法及原理一纸电泳二薄层电泳三薄膜电泳四凝胶电泳（比凝胶层析效果好）1.凝胶的组

7、成与制作组成：单体+交联剂+催化剂制作：三种成分混合溶解即可2.单体、交联剂与凝胶网孔大小的关系单体浓度↑→网孔大小↓交联剂浓度占5%→网孔最小3.连续凝胶电泳三连续：单体浓度、PH、缓冲液连续※不连续凝胶电泳1.三个不连续：单体浓度、PH、缓冲液不连续2.三种效应：电荷效应、分子筛效应、浓缩效应3.三层：样品胶层：最上层，与样品混合浓缩胶层：样品大多因分子太大浓缩于此分离胶层：需分离出的样品通过浓缩层，聚集