酶的提取与分离纯化(I)

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1、第三章酶的提取与分离纯化电泳（electrophoresis,EP）：指带电粒子在电场中向着与其所带电荷性质相反的电极方向移动的过程。电泳技术是根据各种带电粒子在电场中迁移速度的不同而对物质进行分离的实验技术。★第四节电泳一、电泳的基本理论1.原理:在一定pH条件下（用buffer），不同大小、形状及带电颗粒在电场中的移动速度不同（用迁移率表示），各自集中到特定的位置上而形成紧密的泳动带。+-★影响迁移率的因素：颗粒性质：Q越大、r越小、形状越接近球形，v越快。电场强度：E越高，v越快。电泳液：pH值：离pI越远，v越快。（用buffer保持恒定）离子强度：离子强度越高，

2、v越低。通常，缓冲液离子强度在0.02-0.2之间。电渗：在电场中，液体对于固体支持物的相对移动。应避免用高电渗物质作支持介质。★自由界面电泳：又称移动界面电泳，指在没有支持介质的溶液中进行的电泳。区带电泳:指有支持介质的电泳，待分离物质在支持介质上分离成若干区带。支持介质的作用:防止电泳过程中的对流和扩散。2.电泳的分类★按支持介质种类的不同，区带电泳可分为：①纸电泳：用滤纸作支持介质，用于核苷酸定性定量分析。②醋酸纤维素薄膜电泳：常用于分析血清蛋白、胎盘球蛋白，优点是简便迅速，便于保存照相，比纸电泳分辨率高。以上两种类型的电泳，由于介质的孔径度大，没有分子筛效应，主要

3、靠被分离物的电荷多少进行分离。★③琼脂糖凝胶电泳：一般用于核酸的分离分析。琼脂糖凝胶孔径度较大，对大部分蛋白质只有很小的分子筛效应。④聚丙烯酰胺凝胶电泳：用于核酸和蛋白质的分离、纯化及检测。分辨率高。聚丙烯酰胺和琼脂糖是目前实验室最常用的支持介质。★3.电泳常用设备（1）电泳仪：提供稳定直流电源的装置。常压电泳仪（600V）高压电泳仪（3000V）超高压电泳仪（30000V～50000V）（2）电泳槽：自由界面电泳槽管状电泳槽板状电泳槽（3）附属设备：★二、聚丙烯酰胺凝胶电泳！聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamidegelelectrophoresis，PAGE）

4、是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种电泳方法。★1.原理聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体（Acr）和交联剂N，N’-甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂和加速剂作用下聚合的。★CH2=CHC=ONH2CH2=CHC=ONHCH2NHC=OCH2=CH-CH2-CH-[CH2-CH-]nCH2-CH-C=OC=ONH2NHCH2NHC=O-CH2-CH-[CH2-CH-]nCH2-CH-C=OC=ONHNH2丙烯酰胺N,N’-甲叉双丙烯酰胺聚丙烯酰胺★AcrBis聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化体系有两种：1）化学催化系统：AP-TEMED催化剂：过硫酸铵（ammoniumpersulf

5、ate，AP）加速剂：TEMED（N，N，N’，N’-四甲基乙二胺）2）光催化系统：核黄素－光－（TEMED）催化剂:核黄素（维生素B2）引发剂:光TEMED的存在，可加速聚合。.★凝胶浓度越大（小），孔径越小（大），可分离分子量较小（大）的颗粒。Acr与Bis的重量比应在30左右。凝胶浓度和交联度与孔径大小的关系★样品分子量（Da）适宜的凝胶浓度（％）蛋白质<1041～4×1044×104～1×105105～5×105>5×10520～3015～2010～155～102～5聚丙烯酰胺凝胶浓度参考表★2.分离效应PAGE根据其有无浓缩效应，分为：连续电泳采用相同孔径的凝胶

6、和相同的缓冲系统不连续电泳采用不同孔径的凝胶和不同缓冲体系电荷效应不连续PAGE分子筛效应浓缩效应连续PAGE★电荷效应:分离胶中，蛋白质表面净电荷不同，迁移率不同。分子筛效应：大小和形状不同的样品分子通过一定孔径的分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率。浓缩效应：使样品在浓缩胶中被浓缩成一条窄带，然后再进入分离胶进行分离。★不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳系统的不连续性表现在以下几个方面：1.凝胶分上、下两层，上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。2.缓冲液离子组成及各层凝胶的pH不同。电极缓冲液为pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液，浓缩胶为pH6.8的Tris-

7、HCl缓冲液，分离胶为pH8.8的Tris-HCl缓冲液。3.在电场中形成不连续的电位梯度。不连续系统，有三种物理效应，即样品的浓缩效应，凝胶的分子筛效应和电荷效应，提高了分辨率。★三、SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodiumdodecylsulphate-polyacrylamidegelelectrophoresis,SDS-PAGE）简称SDS－PAGE。是目前测定蛋白质亚基相对分子量的一种最好的办法。★1.原理：SDS是种阴离子去污剂，带有大量负电荷，与蛋白质结合后使蛋白质所带负电荷大