酶的分离纯化.ppt

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1、第四章酶的分离纯化及产品成型（1）酶的抽提（2）酶的分离纯化：沉淀分离、离心分离、膜过滤、层析分离、电泳分离（3）酶液的浓缩、结晶、干燥、成型（4）酶纯化过程的纯度监测本章知识点：一、生物下游加工技术下游加工过程包括目标产物的提取、浓缩、纯化及成品化等过程。生物产物从原料（培养液或细胞）生产到产品的后处理技术（分离纯化技术）的发展，使低成本、高收率地纯化目标产物成为现实。大多数酶的回收纯化过程成本约占70%；医用酶的生产回收过程的成本高达85%；基因工程表达产物的回收纯化过程成本一般占85-90%以上；青霉素回收过程成本约占50%；乙醇的回收过程成本仅占14%

2、。二、分离纯化的一般流程原料液细胞分离（离心、过滤）细胞（胞内产物）清液（胞外产物）细胞破碎碎片分离粗分离纯化成品化线路2线路1人干扰素、是一种重要蛋白类生物药品，具有抗癌和治疗肝炎等作用。Yonehara等人：醋酸锌盐析离子交换层析硫酸铵盐析铜螯合层析疏水层析凝胶电泳staehelin等人：硫酸铵盐析免疫亲和层析阳离子交换层析（83.0%）（62.7%）（96.2%）（46.0%）（78.3%）（88.9%）共六步，总收率仅为16%仅三步，总收率达81.0%在实践工作中选择方法时:首先，应对被纯化的酶的理化性质有—个比较全面的了解;其次，判断采用的方法和条件

3、是否得当，始终以测定酶活性为标准。再者，在纯化工作中，往往不宜重复采用相同的步骤和条件。最后，要严格控制操作条件。随着酶的逐步纯净，杂蛋白含量亦逐步降低，蛋白质之间的相互作用力随之下降,酶更不稳定，因此,更要防止酶变性。三、酶分离纯化的基本原则（一）酶分离纯化包括三个基本环节抽提纯化精制（二）酶分离纯化应注意以下问题1、防止酶变性失活：温度、pH、泡沫、重金属等。2、选择有效的纯化方法。3、酶活性测定与总蛋白质含量测定应贯穿纯化过程的始终。第一节从发酵液制取酶提取液（酶溶液的制备）一、发酵液的预处理目的：降低粘度，便于固液分离方法：（1）加热：适用于耐热的酶，

4、注意常要加适当的酶保护剂。（2）加凝聚剂或絮凝剂（3）调pH值二、固液分离方法：（1）离心分离；（2）过滤；（3）双水相萃取三、细胞破碎机械破碎法物理破碎法化学破碎法：甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等有机溶剂和Triton、Tween等表面活性剂酶促破碎法捣碎法：捣碎机研磨法：研钵、细菌磨、石磨、球磨等匀浆法：匀浆器温度差破碎法：冻融交替法压力差破碎法：高压冲击法、突然降压法、渗透压变化法超声波破碎法自溶法加酶处理G+菌：溶菌酶G-菌：溶菌酶、巯基乙醇等酵母菌：β-葡聚糖酶和溶菌酶霉菌：几丁质酶四、抽提（一）抽提方法指在一定的条件下，用适当的溶剂处理含酶原料，使酶充分

5、溶解到溶剂中的过程，也称为酶的提取。四稀：稀酸、稀碱、稀盐、稀有机溶剂（二）抽提过程中的注意事项1、pH值：选择的pH值不超出酶的酸碱稳定范围；最好远离待抽提酶的等电点。2、温度：通常控制在0~4℃左右，尤其是采用有机溶剂提取时。3、抽提液体积（用量）抽提液的用量一般为含酶原料体积的2~5倍。可一次抽提，也可分几次反复抽提。4、为提高酶的稳定性，可以加入适量的保护剂。分离依据的性质分离方法根据分大小、轻重离心分离、凝胶过滤、膜分离根据溶解度大小盐析沉淀、有机溶剂沉淀、共沉淀、选择性沉淀、等电点沉淀根据电学性质离子交换层析、电泳分离根据稳定性差异选择性热变性法、

6、选择性酸碱变性法、选择性表面变性法根据亲和作用亲和层析、亲和电泳酶分离纯化方法：现有的纯化方法，都是以酶与杂蛋白在理化性质、稳定性上的差异以及酶的生物学特性为依据而建立起来的。第三节酶的沉淀分离盐析沉淀法√、等电点沉淀法、有机溶剂沉淀法、复合沉淀法一、盐析沉淀法1、原理：2、硫酸铵盐析的优点优点：①在水中溶解度大，溶解的温度系数小；②价廉，便宜；③可保护酶。缺点：溶解过程随浓度增加的体积变化是非线性的变化。3、盐析操作（1）硫酸铵的饱和度×100%（NH4）2SO4的饱和度（%）=实际浓度饱和浓度0.4S=40%（饱和度）（2）调整盐浓度的方法加饱和（NH4）

7、2SO4溶液：VV0（S2-S1）1-S2=V0—原来溶液的体积V—所需加入饱和硫酸铵的体积S1—原来溶液的硫酸铵饱和度S2—所需达到的硫酸铵饱和度例：将2升0.2S的硫酸铵溶液提升至0.5S，需加饱和硫酸铵多少升？溶液体积增加多少倍？加固体（NH4）2SO4：WB（S2-S1）1－AS2=W—将1L饱和度为S1的溶液提高到S2所要添加的固体硫酸铵克数；A、B—与温度有关的经验常数例：某酶制剂厂生产15吨蛋白酶发酵液，用硫酸铵进行盐析,要求硫酸铵的饱和度达到40%，计算需要加入固体硫酸铵多少kg?（25℃）经验常数0℃10℃20℃25℃30℃A0.2710.2

8、810.2900.2940.298B（