《酶的分离与纯化》PPT课件

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1、第四讲酶的分离与纯化讲课：阳飞系部：生化系C-312制作：郑穗平第四讲酶的分离与纯化教学目标：了解酶纯化方法的原理、步骤、特点以及策略理解酶分离纯化的一般原则、酶分离和纯化方法掌握细胞破碎的方法及酶分离纯化的方法及原理教学重点：细胞破碎的方法与特点、酶分离方法教学难点：酶分离方法特点第四讲酶的分离与纯化4.1、酶的提取和分离纯化4.2、酶的分离纯化策略4.3、酶的分离纯化与制备过程GoGoGo4.1、酶的提取和分离纯化细胞破碎提取酶酶分离纯化酶浓缩酶贮存动物、植物或微生物细胞发酵液离心分离、过滤分离、沉淀分离、层析分离、电泳分离、萃取分离、结晶分离等指把酶从组织中、细胞内或细胞外液中提取出来并

2、使之达到与使用目的相适应的纯度。已知绝大多数酶是蛋白质，因此用于蛋白质分离纯化的方法一般也适用于酶的分离纯化。酶的分离纯化一般程序：①预处理：材料的选择、发酵液预处理、细胞破碎②粗分级分离：又称初步纯化或提取，采用适当的方法将目的酶与其他杂蛋白分离开③细分级分离：又称高度纯化，即酶的精制④成品制作：使酶与溶剂分离。4.2、酶的分离纯化策略①防止酶的变性失活②储存及所有操作一般在低温下（0～4℃）进行③整个过程中反应系统pH要适中（pH4～6）④操作中应尽量避免激烈搅拌以减少泡沫形成1、基本原则2、分离纯化策略1）目的明确2）建立一个可靠、快速的分析方法3）纯化方法的选择1）目的明确酶分离纯化的

3、最终目的就是要获得高纯度的酶，使用的目的不同，对酶的纯度要求也不同。纯度的要求必须考虑到原料的性质、终产物的预期用途和特殊的安全性问题。所有关于目标酶蛋白及关键杂质的性质的信息都有助于指导人们在纯化过程中选择分离技术和操作条件。虽然纯化的步骤越少越好，但必须保证终产物的质量。应尽早除去可引起目标蛋白降解、失活或干扰分析的杂质。在每个纯化步骤中都应考虑维持酶蛋白的生物活性。2）建立一个可靠、快速的分析方法①快速、可靠的分析目标酶蛋白的方法②蛋白质纯度检测方法③总蛋白量检测方法④对必须清除的杂质的分析方法3）纯化方法的选择纯化过程不宜重复相同的步骤和条件减少添加剂的使用尽早去除有破坏性的杂质尽早采

4、用高效分离方法，将最昂贵最费时的分离方法放在最后阶段评价纯化方法好坏标准：比活力提高倍数、总活力的回收率、重现性酶纯度检验：电泳法、高效液相色谱法(HPLC)、化学结构分析法、超离心沉降分析法、免疫学法、分光光度法4.3、酶的分离纯化与制备过程1、材料的预处理2、细胞破碎（胞内酶）3、酶的提取4、酶的分离纯化方法及选择5、酶的精制及方法6、酶制剂的类型1、材料的预处理酶的来源于动物、植物的器官组织、微生物细胞发酵。微生物细胞产酶包括胞内酶与胞外酶，两种情况都涉及将微生物细胞与发酵液进行分离。常用的分离方法主要是离心和过滤两种。2、细胞破碎（胞内酶）指采用物理、化学或生物的方法使细胞壁或细胞膜破

5、碎，从而使得细胞内的酶得到释放。细胞破碎的方法可分为机械法和非机械法两类。目前工业上最常用的是机械法。JY92-IID超声波细胞粉碎机高压细胞破碎机DY89-I型电动玻璃匀浆机细胞破碎珠机械破碎捣碎法研磨法匀浆法物理破碎温度差破碎法压力差破碎法超声波破碎法化学破碎★有机溶剂：甲苯、丙酮丁醇、氯仿★表面活性剂：Triton、Tween酶促破碎自溶法外加酶制剂法通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎★细胞

6、破碎方法及其原理3、酶的提取指在一定条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程,也称为酶的抽提。首先应根据酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂。一般说来，极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非极性的有机溶剂中；酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易溶于酸性溶剂中。一般酶都能溶解于水，通常可用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行提取，有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，则可用有机溶剂提取。为了提高酶的提取率并防止酶的变性失活，在提取过程中还要注意控制好温度、pH值等提取条件。★酶的主要提取方法提取方法使用的溶剂或溶液提取对象盐溶液提取0.02～0.5mol/L的盐溶

7、液用于提取在低浓度盐溶液中溶解度较大的酶酸溶液提取pH2～6的水溶液用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且稳定性较好的酶碱溶液提取pH8～12的水溶液用于提取在稀碱溶液中溶解度大且稳定性较好的酶有机溶剂提取可与水混溶的有机溶剂用于提取那些与脂质结合牢固或含有较多非极性基团的酶讨论：提高酶分子扩散速度手段提高温度降低溶液粘度增加扩散面积缩短扩散距离增大浓度差？4、酶的分离纯化方法一、根据溶解度不同建立的纯