《酶的分离纯化》ppt课件

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1、第三章酶的分离纯化本章重点各种分离方法的操作原理分离方法的应用原则酶分离纯化中应注意的问题酶制剂的来源3.1酶纯化的必要性3.2起始材料的选择3.3酶的萃取3.4分离方法3.5酶纯化步骤的设计3.6纯化步骤的定量评价3.7在纯化过程中酶活力的损失3.1酶纯化的必要性生物细胞中同时存在多种多样的酶。酶在生物细胞中的分布并不是均一的。许多酶可能作用于同一个底物。某种酶的纯化程度根据研究目的而定。3.2起始材料的选择不顾及酶的来源时，可选择酶含量高的材料。微生物培养物注意材料的年龄注意在生物体内的富集区域3.3酶的萃取（处理液应及时处理，否则在均浆上加一薄层甲苯可以防止微生物感染。

2、）（1）膜和细胞壁的破碎：研磨、超声波、高压（注意胞外酶的测定）（2）酶的萃取：萃取液3倍于起始材料缓冲液(pH7.5)的作用，中和从空泡中放出的大量酸；高离子强度(0.1-0.5)有助于将酶从结合的膜上解析下来；丙酮粉有助于将酶与脂肪或磷脂膜分离。注意事项：蛋白酶的抑制方法（低温快速、抑制剂）制备丙酮粉用以解除酶与脂肪或磷脂膜的结合。除去核酸：调整pH沉淀（鱼精蛋白硫酸盐或链霉素）、水解3.4酶的分离方法（1）以大小或质量为依据：离心（300000g)、凝胶过滤（Sephadex交联葡聚糖、Bio-Gel交联聚丙烯酰胺）、透析、超过滤（2）以电荷为依据：离子交换色谱（低离子

3、强度、适当pH）Sephadex、DEAE-纤维素、CM-纤维素；电泳（电荷、分子大小、分子形状）纸、纤维素粉末、淀粉、聚丙烯酰胺；等电聚焦（pH梯度中的平衡位置）（3）以溶解度变化为依据：改变pH、改变离子强度、降低介电常数（4）以特异性结合位置为依据：亲和色谱、亲和洗提（5）其它方法：热变性、在磷酸钙凝胶柱上分级吸附、羟基磷灰石色谱、疏水色谱、用水溶性的非离子聚合物（聚乙二醇）沉淀、冷冻干燥浓缩分离方法分解(1)以大小或质量为依据离心凝胶过滤透析和超过滤1.1离心原理：以质量不同为分离依据离心力5000-50000g处理量可达几升分离对象:细胞碎片、沉淀下来的酶高速离心速

4、度一般在20,000以下。超离心相对离心力场速度在75,000g以上，在80,000~250,000g之间。主要分离小分子量酶。沉降速度,离心法（区带离心法），等密度梯度离心法（沉降平衡法）。1.2凝胶过滤原理：不同大小的分子进入颗粒状凝胶内微孔的能力不同，能进入微孔的小分子被阻滞，不能进入微孔的大分子未被阻滞。换句话说，分离是因为不同分子在进入或不进入凝胶所经过的路程不同而达到分离的目的。其他名称：分子筛层析、凝胶渗透层析、排阻层析Sephadex(交联葡聚糖）、Bio-Gel(交联聚丙烯酰胺）酶后期处理（小量试样）葡聚糖凝胶操作流程：1）选择根据分子量大小范围选择凝胶。凝

5、胶如:G50排阻1,500-30,000（Sephadex）还有粗，中，细分，细的分辩率高,流速慢；粗的分辩率低,流速快。2）溶涨水浸或沸水煮，快而可以杀菌，防止微生物污染。3）装柱不能有气泡，用缓冲液平衡4）上样按柱床体积计算约1/40左右。然后用缓冲液洗脱。注意流速。5）再生稀盐和缓冲液洗涤，保存在液体中，为防止微生物生长，加0.02%NaN3使用时要注意可能抑制你要分离的酶。聚丙烯酰胺凝胶丙烯酰胺与甲叉丙烯酰胺聚合而成。Bio-GelP-2数字后面乘1000表示最高排阻分子量分离生物大分子的范围与葡聚糖凝胶基本相同琼脂糖凝胶是琼脂去除琼脂胶后得到D-半乳糖和6-脱水Se

6、pharose半乳糖相间排列而成。如：4B即琼脂糖含量占4%。另外的商品Bio-GelA是琼脂糖与丙烯酰胺交联而成。Bio-GelCL，比上述二种化学稳定性和机械强度更好，应用更大。作用：浓缩，脱盐等，分级分离1.3透析和超过滤透析膜：带有微孔的筛子小于等于20000的大分子通过，更大的分子不通过。除去酶液的盐、有机溶剂或低分子量的抑制剂超过滤：在0.29MPa氮气压力下使酶液透过透析膜。浓缩酶液(2)以电荷为依据离子交换色谱电泳等电聚焦2.1离子交换色谱取决于带相反电荷基团的静电吸引。DEAE-纤维素（二乙基氮基乙基-纤维素）结合带负电荷基团，阴离子交换剂CM-纤维素（羧甲

7、基-纤维素）结合带正电荷基团，阳离子交换剂离子交换纤维素:是纤维素作为母体，引入相应的交换基团，蛋白质不容易变性，交换容量大（0.2-1.0mg/克干胶）离子交换树脂:聚苯乙烯树脂引入相应的解离基团，分阴，阳离子交换树脂。有强酸，强碱，弱酸，弱碱。离子交换凝胶:葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶为母体，导入相应的交换基团，交换容量更大2.5-4.5mg/克干胶）1）离子交换剂选择：考虑酶稳定性需要酶蛋白在くpI的pH条件下稳定用阳离子交换剂。酶蛋白在〉pI的pH条件下稳定用阴离子交换剂在﹤pIpH,﹥pIpH条件下