《酶的分离纯化》PPT课件(I)

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1、第四章酶的提取与分离纯化将酶从细胞或发酵液中取出，再与杂质分开，获得所需的酶产品。酶的分离纯化工作,是酶学研究的基础.酶的纯化过程就目前而言,还是门实验科学.酶的纯化过程与一般蛋白纯化过程相比有本身独有的特点:一是特定的一种酶在细胞中含量很少;二是酶可通过测定活力的方法加以跟踪.1、建立一个可靠和快速的测活方法；2、酶原料的选择；3、酶的提取；4、酶的提纯；5、酶的纯度检验。酶分离纯化的一般原则:第一节细胞破碎（link)第二节酶的提取(link)第三节沉淀分离(link)第四节离心分离第五节过滤与膜分离第六节层析分离第七节电泳分离第八节萃取

2、分离第九节酶的结晶第十节浓缩与干燥本章主要内容:go第一节细胞破碎一般动物组织和细胞可用电动捣碎机或匀浆器破碎或用超声波处理破碎。植物组织和细胞由于具有纤维素、半纤维素和果胶等物质组成的细胞壁，一般常用与石英砂和适当的提取液一起研磨的方法破碎或用纤维素酶处理也能达到目的。细菌细胞的破碎比较困难，因为整个细菌细胞壁的骨架实际上是一借共价键连接而成的肽聚糖囊状大分子，非常坚韧。破碎的方法常有超声波震荡、与石英砂研磨、高压挤压或溶菌酶处理（以分解肽聚糖）。细胞的破碎方法：一、机械破碎法二、物理破碎法三、化学破碎法四、酶学破碎法back原理：机械运动

3、所产生的剪力作用于细胞1机械捣碎法：捣碎机，10000rpm，实验、生产规模均可2研磨法：研钵、石磨、球磨、细菌磨等研磨器械，效率较低3匀浆法：匀浆器，用于颗粒细小的组织细胞破碎程度高。对酶破碎少，难于工业化。Back一、机械破碎法包括:1、温度差破碎法;2、压力差破碎法;3、超声波破碎法;二、物理破碎法通过温度、压力、声波等各种物理因素的作用使组织细胞破碎1、温度差破碎法冷冻高温，用于脆弱易破菌，难以工业化;于冷藏库或干冰反复于零下15～20℃使之冻固，然后缓慢地融解，如此反复操作，使大部分细胞及细胞内颗粒破坏。由于渗透压的变化，使结合水冻

4、结产生组织的变性，冰片将细胞膜破碎，使蛋白质可溶化，成为粘稠的浓溶液，但脂蛋白冻结变性。或:将材料投入沸水中，于90℃左右维持数分钟，立即置于冰浴中使之迅速冷却，绝大部分细胞被破坏。2、压力差破碎法高压冲击法用活塞或冲击锤加高压冲击菌体细胞和冰晶石英沙等混合物。突然降压法加压至30MP以上，打开出口阀突然降为常压爆破性减压法用氮气或二氧化碳充压至几十至几百大气压。渗透压差法利用渗透压的变化而使细胞破碎，常用于从海洋微生物中提取某些酶。频率10~20KHz，功率100~150W，温度0~10oC，pH4~7，时间3~10min，间隔多次;对数生

5、长期细胞，细胞浓度和溶液粘度不宜太高。暴露于9～10kHz声波或10～500kHz超声波所产生的机械振动，只要有设备该法方便.且效果也好，但一次处理量较小;应用超声波处理时应注意避免溶液中气泡的存在;处理一些超声波敏感的蛋白质酶时宜慎重。3、超声波破碎法在超声波的作用下，细胞膜由于空穴作用而破碎。破坏程度与输出功率、破碎时间密切相关，与频率关系不大。操作条件Back三、化学破碎法应用各种化学试剂与细胞膜作用，使细胞膜的结构改变或破坏。有机溶剂（如甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等）可使细胞膜的磷脂结构破坏，从而改变细胞膜的透过性，再经提取可使膜结合酶或

6、胞内酶等释出胞外。1、有机溶液粉碎后的新鲜材料在0℃以下加入5～10倍量的丙酮，迅速搅拌均匀，可破碎细胞膜，破坏蛋白质与脂质的结合。蛋白质一般不变性，被脱脂和脱水成为干燥粉末。用少量乙醚洗，经滤纸干燥，如脱氢酶等可保存数月不失去活性。操作表面活性剂(溶于液体后，具有使表面张力显著降低作用的物质)和细胞膜中的磷脂及脂蛋白相互作用，使细胞膜结构破坏，增加膜的透过性。离子型表面活性剂会使酶的结构破坏，不用之。常用的非离子型表面活性剂为：Triton(辛基酚聚氧乙烯醚,聚乙二醇辛基苯基醚);Tween(聚氧乙烯山梨醇酐单棕榈酸酯,吐温,聚氧乙烯山梨醇

7、酐三硬脂酸酯)用凝胶层析等方法除去表面活性剂，以便酶的进一步纯化。对膜结合酶的提取特别有效。2、表面活性剂Back四、酶学破碎法在一定条件下，通过外加的酶或细胞本身存在的酶的作用，使细胞破碎。简单原理:溶菌酶处理时，它能水解构成枯草菌等菌体膜的多糖类。能溶解菌的酶分布很广。尤其卵白中含量高，而多易结晶化。1、外加酶1g菌体加1～10mg溶菌酶，pH6.2～7.01h内完全溶菌。于生理食盐水或0.2mol蔗糖溶液中溶菌，虽失去细胞膜，但原形质没有脱出。蜗牛酶及纤维素酶也常被选为破坏细菌及植物细胞用。革兰氏阳性菌：细胞结构和形状依赖于壁上的肽多糖

8、，溶菌酶能专一性作用于肽多糖的β-1，4-糖苷键。革兰氏阴性菌：除了溶菌酶外，另加EDTA才有效。酵母：其细胞壁的主要成分是β-1，3-葡聚糖，需加β-葡聚糖酶；霉