酶的分离和纯化.ppt

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1、第二章酶的分离和纯化IsolationandPurificationofenzyme方法概括原料处理：包括组织破碎、缓冲液抽粗分级：一般采用硫铵沉淀、乙醇沉淀或其他方法细分级：一般采用离子交换层析、凝胶层析、亲和层析和电泳第一节原料选择及预处理动物原料：动物组织或脏器（活体取出）充分脱血-10℃—-50℃保存植物原料：植物原料磨碎加入缓冲液抽提植物原料特点：1）纤维含量高2）酚酶活力高3）缓冲液pH易被细胞内物质改变微生物原料：菌体培养做酶活—时间曲线确定最大酶活时间细胞破碎微生物细胞破碎一般采用1）化学法：碱；去垢剂；有机溶剂；酶解；冰冻复融

2、2）物理法：热处理；渗透压；减压；声波振荡3）机械法：加磨料；研磨；挤压4）缓冲液抽提抽提缓冲液的加入要少量多次，植物酶抽提时可加5mM的Vc第二节酶的粗提沉淀核酸沉淀：a）MnCl2、硫酸鱼精蛋白、链霉素可使核酸沉淀，离心除掉（b）加入核酸酶将其降解杂蛋白沉淀：根据目的酶的特性方法各异选择性沉淀（盐析）：最常用的方法沉淀过程中随时监测蛋白浓度和酶活力讨论：（a）盐的加入速度合适（b）蛋白质开始沉淀处的硫铵浓度与蛋白浓度有关（c）硫铵浓度表示法；饱和度25℃4.1M（d）硫铵饱和溶液pH<7，若目的酶易酸变性必须用缓冲液（e）硫铵溶液密度较高（

3、1.24），故需较大离心力此步可除去75%以上的杂蛋白，且可使蛋白浓缩透析与浓缩1）透析袋处理：透析袋0.5MEDTA煮半小时蒸馏水煮半小时反复八次带橡皮手套用镊子拿取2）透析除盐：200倍于被透析物；4小时换一次透析液；监测电导值SephadexG25除盐：柱长50cm；上样小于床体积的20%3）浓缩：a）火棉胶b）聚乙二醇（PEG）c）超滤（3-5kg/cm2）d）冻干透析技术原理图超滤技术原理图第三节酶的精制一、层析技术（chromatography）1）分配层析：物质在两相中的分配系数不同a）纸层b）薄层(比纸层灵敏100倍但剥板困难)

4、c）柱层2）吸附层析（absorptionchromatography）：吸附剂对通过它的物质吸附力不同，吸附力包括离子引力、疏水作用、范德华力和氢键a）薄层b）柱层填料一般为硅胶、氧化铝、磷酸钙、活性白土和羟基磷灰石；常用羟基磷灰石;带正电,稳定范围pH5.5-10,吸附量1mg/g湿剂纸层薄层3）离子交换层析（ionexchangechromatography）：交换剂上带电荷，可根据样品的电荷予以分离a）阳离子交换层析b）阴离子交换层析c）离子交换剂的类型：离子交换树脂、离子交换纤维素、离子交换凝胶d）实验室常用的离子交换剂：阴离子交换剂

5、DEAE-Cellulose、DEAE-Sephadex；阳离子交换剂CM-Cellulose、CM-Sephadexe）离子交换剂的预处理：去杂质；溶胀；除小颗粒；改型阳离子交换剂：碱→水→酸→水→平衡阴离子交换剂：酸→水→碱→水→平衡f）柱层析：床体积等于2-5倍束缚样品需要量；径∶高=1∶15；上样量不超过柱体积的10%（*注意上样方法）；洗脱方法有两种——不连续梯度洗脱和连续梯度洗脱；分布收集器收集每管2-3mlg）交换剂后处理：饱和NaCl→水→酸或碱→水→平衡连续梯度洗脱梯度混合器离子交换层析阳离子交换剂阴离子交换剂Anionexc

6、hangechromatography4）凝胶层析（分子筛层析）（gelfiltrationchromatography）：根据分子量大小予以分离a）凝胶预处理：凝胶→浸入洗脱液→轻轻搅拌↓加热90-100℃（水浴加热）b）层析柱准备：φ2.5×100柱；稠胶灌柱；2-3个床体积的缓冲液平衡；流速16-18ml/hc）层析：兰葡聚糖（分子量2×106）验柱并求外水体积（V0）；上样量1-5%；恒压洗脱；流速16-18ml/hd）凝胶后处理：0.5NNaOH+0.5NNaCl处理后4℃保存长时间不用可采用乙醇脱水保存或低温干燥保存凝胶过滤层析原理

7、图Gelfiltrationchromatography5）亲和层析（affinitychromatography）特异性结合a）关键：配体；配体与支持物的连接方法；吸附、洗脱条件b）支持物的选择：非特异性吸附作用低；液体流动性好；较宽的pH、离子强度；丰富的化学基团；有效的多孔性常用琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶和受控多孔玻璃球c）配体的选择：有亲和力但不易过大d）配体与支持物的连接：载体结合法；物理吸附法；交联法；包埋法（先活化支持物上的功能基团再将配体连上去）e）吸附剂的衍生物：支持物+空间臂f）层析条件的选择：蛋白质+配体→蛋白质-配体复合物起

8、初配体浓度恒定，随蛋白浓度增加平衡右移（逐渐保留特性），故亲和力较低也能成功的亲和。g）洗脱：更高亲和力的物质置换；剧烈改变环境条件亲和层析原理Aff