牛血中SOD的分离纯化步骤.doc

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1、1.前言超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD，ECl.15.1.1)广泛存在于动物、植物和微生物中，是一种能专一地清除超氧阴离子自由基(O—2)的金属酶[1]。按所含金属离子不同可分为Cu—Zn—SOD、Mn—SOD和Fe—SOD[2]。SOD催化反应：2H++2O—2→2H2O2+O2。SOD对过量的O—2的及时清除保证了机体内O—2的含量相对平衡，对机体起防护作用[3]。国内外研究表明SOD具有抗炎、抗衰老抗辐射[4]等重要作用[5]。我国近年来在植物SOD的研究领域有大量相关进展报道。许平[6]、袁艺[7]、赵文芝[8]、余旭亚[9]等分别从大蒜

2、、桑叶、沙棘、仙人掌中提取出SOD并进行相关研究。SOD的制备方法随原料而异，目前国内外制备SOD的原料有动物血[10]、微生物和动植物组织。牛血通常不会进行再加工，本文旨在通过牛血中SOD的研究，为牛血SOD的开发利用提供依据。2.材料与方法2.1材料2.1.1仪器50ml离心管，500ml烧杯，200ml烧杯，电子天平，冷冻离心机，试管，恒温水浴锅，紫外分光光度计，电泳仪，垂直电泳槽，培养皿（染色用），移液器（1000ul、100ul、50ul、10ul），YC-1层析柜，混合器，恒流泵，紫外检测仪，自动收集装置，记录仪等。2.1.2材料新鲜牛血（购于北京市牛街），Seph

3、adexG-100凝胶2.1.3试剂(1)磷酸缓冲液（pH7.6、2.5mmol/L）(2)考马斯亮蓝G-250试剂：称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50ml95%乙醇中，加入100ml85%的磷酸，蒸馏水定容至1000ml。此试剂常温下可保存30天。(3)标准蛋白(BSA)标准蛋白质溶液：精确称取结晶牛血清白蛋白25mg，加蒸馏水溶解并定容至100ml。吸取上述溶液40ml，用蒸馏水稀释至100ml，即为100ug/ml的标准蛋白质溶液。(4)SOD活力测定试剂①50mmol/LpH8.2Tris—HCl缓冲液（Tris0.61g，EDTA—Na20.037g，0.1

4、mol/LHCl调PH8.20，定容至100ml）；②45mmol/L邻苯三酚溶液（用10mmol/L盐酸配制）。③10mmol/L盐酸。(1)40%蔗糖：称取40g蔗糖加重蒸水100ml。(2)10%过硫酸铵(AP)：称过硫酸铵10g，溶于100ml重蒸水中。用时现配。(3)电极缓冲液：称取Tris(三羟甲基氨基甲烷)6g，甘氨酸28.8g。用蒸馏水溶解并定容至1000ml。用时稀释10倍。(4)胶贮液（30%的Acr/Bis溶液）：称丙烯酰胺Acr29.1g，甲叉双丙烯酰胺Bis0.9g，加重蒸水溶解，定容至100ml，过滤后装入棕色瓶，4℃保存。(5)分离胶缓冲液：Tri

5、s（三羟甲基氨基甲烷）36.6g，加1mol/LHCl48ml，用浓盐酸调pH8.9，再用蒸馏水定容至100ml。(6)浓缩胶缓冲液：Tris6.0g，加1mol/LHCl48ml，TEMED0.4ml，用浓盐酸调至pH6.8后，再用蒸馏水定容至100ml。(7)脱色液：乙酸。(8)TEMED2.2方法2.2.1收集红细胞、溶血取加入抗凝剂的新鲜牛血300ml，充分摇匀，3000r/min离心20min除去血浆，收集沉淀（红细胞），加入等体积0.9%NaCl溶液，用玻璃棒搅起充分洗涤，3000r/min离心20min，弃去上清液（重复3次，上层液体为淡黄色），收集洗净的沉淀（红

6、细胞）放入500ml烧杯中，加入等体积ddH2O，将烧杯置于冰浴中搅拌溶血30min，得溶血液约200ml，放入YC-1层析柜中（0~4℃）过夜，使红血球充分破裂。2.2.2沉淀血红蛋白向溶血液中加入4℃下预冷的95%乙醇（0.25倍体积，50ml），然后再缓慢加入4℃下预冷的氯仿（0.15倍体积，30ml），搅拌45min，静置2h，冷冻3500r/min离心20min，弃去沉淀（血红蛋白），收集上清液85ml，此即酶的粗提液。上清继续冷冻3500r/min离心20min。2.2.3SOD富集向酶粗提液加入35gK2HPO4•3H2O（按43gK2HPO4•3H2O：100m

7、l粗提液的比例），充分搅匀，转移到分液漏斗，震摇后静置15min，见明显分层。收集含SOD上层乙醇-氯仿相（微浑浊，42ml），室温下3500r/min离心25min，弃去沉淀，得上清液约40.5ml。2.2.4SOD纯化2.2.4.1沉淀。在上清液中加入等体积4℃预冷的丙酮40ml，搅拌均匀，YC-1层析柜中静置20min，3500r/min离心20min收集沉淀物。2.2.4.2溶解。向沉淀中加入少量去离子水溶解，4500r/min离心20min，合并两次上清，共23ml。2.2.4.3