分离纯化的前期步骤

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1、第八章生化物质的制备和分离纯化生化物质的制备和分离纯化分离纯化的一般步骤选材细胞破碎抽提分离纯化结晶纯度鉴定保存8.1分离纯化的一般步骤选材细胞破碎抽提分离（沉淀法、离子交换法）纯化（分子筛、电泳）结晶纯度鉴定保存分离提纯某一特定蛋白质的一般程序可以分为前处理粗分级细分级第一步是前处理(pretreatment)。分离提纯某一蛋白质，首先要求把蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来，并保持原来的天然状态，不丢失生物活性。第二步是粗分级(roughfractionation)。当蛋白质混合物提取液获得后，选用一套适当方法，将所要的蛋白质与其他杂蛋白质分

2、离开来。一般这一步的分级用盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法。第三步是细分级(finefractionation)，也就是样品的进一步提纯。样品经粗分级以后，一般体积较小，杂蛋白大部分已被除去。进一步提纯，一般使用层析法包括凝胶过滤，离子交换层析，吸附层析以及亲和层析等。必要时还可选择电泳法。8.2材料的选择与处理含量高容易得到干扰物质少价格便宜容易分离安全性好清理除杂冷冻干燥浓缩选材含量高容易得到干扰物质少价格便宜容易分离安全性好提取工艺简单有综合利用价值微生物、植物和动物都可做为制备蛋白质的原材料，所选用的材料主要依据实验目的来确定。对于微生物，应

3、注意它的生长期，在微生物的对数生长期，酶和核酸的含量较高，可以获得高产量，以微生物为材料时有两种情况:（1）得用微生物菌体分泌到培养基中的代谢产物和胞外酶等；（2）利用菌体含有的生化物质，如蛋白质、核酸和胞内酶等。植物材料必须经过去壳，脱脂并注意植物品种和生长发育状况不同，其中所含生物大分子的量变化很大，另外与季节性关系密切。对动物组织，必须选择有效成份含量丰富的脏器组织为原材料，先进行绞碎、脱脂等处理。另外，对预处理好的材料，若不立即进行实验，应冷冻保存，对于易分解的生物大分子应选用新鲜材料制备。8.3细胞破碎（1）碾磨法/组织捣碎法（2）超声波破碎法（1

4、0-15KHz）（3）渗透压法（高渗或低渗处理）（4）冻融法（5）表面活性剂处理法（SDS、Tween、TritonX）（6）细胞自溶法（利用细胞自身的酶）（7）丙酮法（冷丙酮脱水抽提）（8）酶处理方法（1）碾磨法/组织捣碎法是最普通和常见的细胞破碎方法。既可以使用普通的高速组织捣碎机、细胞匀浆器，也可使用专门的用于微生物细胞破碎的细菌磨等。(2)超声波破碎法使用专一的超声波破碎仪，利用仪器所产生的超声波（10~15kHz）机械震动后对组织细胞产生的空化作用（Cavitation）使细胞破碎。对动物材料的效果比微生物材料和植物材料要好。(3)渗透压法（高渗或

5、低渗处理）渗透压就是用来抗衡渗透倾向所需的一种力。先将细胞置于高渗溶液(如蔗糖溶液)中平衡一段时间后，突然将其转入到低渗缓冲液和水溶液中，则细胞壁会因渗透压的突然变化而破碎。此法只适于处理细胞壁比较脆弱的细胞。(4)冻融法：将细胞在低温(-15℃)下冰冻后再在室温下融化，如此反复多次就能使细胞壁破裂。此法也只适用于胞壁易破的细胞。(5)表面活性剂处理法：在适当的温度、pH及低离子强度下，表面活性剂（如SDS、Tween、TritonX）能与脂蛋白形成微泡，使膜的渗透性改变或使之溶解。此法对膜结合的酶的提取是相当有效的，但对其他蛋白质则易使之变性，甚至切断肽链

6、。（6）细胞自溶法利用细胞自身的酶(7)丙酮法（冷丙酮脱水抽提）丙酮等脂溶性溶剂可溶解细胞膜上的脂质化合物，从而使细胞膜的结构破坏。一般是将细胞制成丙酮干粉后，再加提取酶。(8)酶处理方法用外源的溶菌酶或细胞壁分解酶(如蛋白酶、脂肪酶、核酸酶等)在一定条件下作用于细胞而使细胞壁破碎。但这种方法因需外加酶制剂，因此可能会对后续目的酶的提取产生不利的影响。8.4抽提物质的抽提常常和细胞破碎步骤协同进行根据被提取物质的溶解特性，选择适当的溶剂始终保持低温操作，防止生物活性物质变性提取的原则是“少量多次”尽量去除干扰物质防止水解酶的作用加入一定的保护试剂其他影响因素

7、：pH、溶剂极性与离子强度等蛋白质（包括酶）的提取大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。（一）水溶液提取法稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂，通常用量是原材料体积的1-5倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于蛋白质的溶解。提取的温度要视有效成份性质而定。一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度高利于溶解，缩短提取时间。但另一方面，温度升高会使蛋白质变性失活，因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采

8、用低温（5度以下）操作。为了避免蛋白质提以过程中的降