核酸的分离与纯化

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1、核酸的分离与纯化基本知识回顾核酸(nucleicacid)：以核苷酸为基本组成单位的生物信息大分子具有复杂的结构DNA重要的功能天然存在的核酸信息的载体RNA信息的储存、传递与表达基本知识回顾DNA模式图第一节核酸分离与纯化的设计与原则DNA组成：染色体DNA、细胞器DNA、质粒DNA。分子总长随生物进化程度而增长RNA分子比DNA分子要小的多。功能多样性种类、大小、结构都具多样性简述DNA与RNA的区别DNA与RNA性质上的差异决定了两者的最适分离与纯化的条件是不同的。一、材料与方法的选择材料与方法的选择临床标本

2、繁多：血液、尿液、唾液、组织及培养细胞等不同的研究目的对核酸的完整性、产量、纯度和浓度可能有不同的要求，还需考虑制备核酸所需的时间与成本，在不影响核酸质量的情况下，应选择完全无毒的试剂与方案。选择原则一是保证核酸一级结构的完整性二是尽量排队其它分子的污染，保证样品的纯度。保持核酸的完整性首先，应尽量避免各种有害因素对核酸的破坏（pH，高温）其次，对无法避免的有害因素，应采取多种措施，尽量减轻各种有害因素对核酸的破坏（提取时间、DNA酶、RNA酶等）。核酸的释放DNA与RNA均位于细胞内，因此核酸分离与纯化的第一步就

3、是破碎细胞、释放核酸。机械法液体剪切法细胞的破碎方法固体剪切法非机械法干燥法溶胞法二、技术路线的设计机械法主要危害高分子的线性DNA，此法不适全于染色体DNA的分离与纯化。（采用适宜的化学与酶能有效的裂解细胞，方法温和，能保证较高的得率和保持核酸的完整性）核酸的分离与纯化：利用核酸与其它物质在一个或多个性质上的差异设计有效方案，才能使核酸得以分离。细胞定位与组织分布上的差异核酸与其它物质的差异：物理化学性质上的不同各自独特的生物学特性二、技术路线的设计续复杂样品核酸分子直接提取核酸分子去除污染物非核酸的大分子污染物

4、非需要的核酸分子对实验有影响的溶液与试剂核酸分离与纯化简易图核酸的浓缩、沉淀与洗涤核酸提取试剂的逐步加入，以及去除污染物过程中核酸分子不可避免的丢失，样品中核酸的浓度会下降二、技术路线的设计续对核酸进行浓缩沉淀是核酸浓缩最常用的方法（加入一定浓度的盐类后屏蔽磷酸基团，用有机溶剂如乙醇、异丙醇沉淀核酸）核酸沉淀往往含有少量共沉淀的盐，需用70%～75%的乙醇洗涤去除核酸的鉴定1.浓度鉴定：可通过紫外分光光度法与荧光光度法进行。紫外分光光度法：原理：核酸分子成分中的碱基具有一定的紫外线吸收特性。核酸的最大吸收波长为26

5、0nm，溶液中核酸的浓度与溶液在260nm紫外线下的吸光度（修正参数：A260－A310）成正比。灵敏度：0.25ug/ml荧光光度法：原理：核酸的荧光染料溴化乙锭（EB）嵌入碱基平面后，使本身无荧光的核酸在紫外线激发下发出检红色的荧光，且荧光强度积分与核酸含量呈正比。灵敏度：1-5ng三、鉴定与保存2.纯度鉴定：紫外分光光度法DNA：在TE缓冲液中，纯DNA的A260/A280比值为1.8蛋白质（280nm）与酚（270nm）使比值下降RNA（260nm）使比值升高RNA：在TE缓冲液中，纯RNA的A260/A2

6、80比值为2.0，但由于RNA二级结构不同，其读数可能在1.8-2.1之间波动。鉴定RNA纯度所用溶液的pH会影响A260/A280读数。三、鉴定与保存2.纯度鉴定：荧光光度法用EB示踪，进行核酸电泳：DNA分子电泳迁移率低；总RNA（三条带）：23SrRNA28SrRNA16SrRNA18SrRNA5SrRNA+tRNA5SrRNA+5.8SrRNA+tRNA三、鉴定与保存原核生物真核生物3.完整性鉴定(1)凝胶电泳法：以溴化乙锭为示踪染料的核酸凝胶电泳结果可用于判定核酸的完整性。DNA：若有降解的小分子DNA，

7、电泳有脱尾RNA：三个条带荧光强度积分应呈特定的比值。(2)其它方法：三、鉴定与保存核酸的保存DNA保存：DNA溶于TE缓冲液（pH8.0）中在-70度可以储存数年；EDTA螯合二价金属离子，可以抑制DNA酶的活性；在DNA样品中加入少量氯仿，可以有效避免细菌与核酸的污染小量分装保存三、鉴定与保存核酸的保存RNA保存1.可溶于0.3mol/L的醋酸钠溶液或双蒸水中,在-70度至-80度保存2.若以焦炭酸二乙酯水（DEPC）溶解RNA或在RNA溶液中加入RNA酶阻抑蛋白或氧钒核糖核苷复合物（VRC)，可延长保存时间3

8、.RNA沉淀溶于70％乙醇溶液或去离子甲酰胺溶液，可在-20度长期保存4.小量分装保存三、鉴定与保存双链DNA因固有的结构特点，是一种惰性很强的化学分子。但由于是很长的线性分子，而且缺乏横向的稳定性，因此很容易断裂。尽管基因组DNA因来源、性质以及用途不同，其分离纯化的方法不尽相同，但有关分离纯化的原则、主要步骤、主要试剂及其作用原理是一样的。第二节基因组D