核酸的分离纯化1

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1、第一节核酸的分离纯化第二节聚合酶链式反应（PCR）第三节凝胶电泳系统第四节核酸的分子杂交第五节核苷酸序列分析第六节基因工程第五章分子生物学实验技术分子生物学研究之所以从20世纪中叶开始得到高速发展，其中最主要的原因就是现代分子生物学研究方法、特别是基因操作和基因工程技术的进步。DNA分子的切割与连接核酸分子杂交凝胶电泳细胞转化核酸序列分析基因的人工合成基因操作基因的定点突变PCR扩增等核心技术基因工程诞生的基础1、理论上的三大成就2、技术上的二大发明三大成就：1.40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题

2、；1928FrederickGriffith&1944OswaldAveryTransformationofStreptococcuspneumoniae1952年Hershey和Chase证实噬菌体DNA侵染细菌实验2.50年代揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题；X-raysourceCrystallizedDNARosalindFranklin拍出了第一张能反映DNA美丽双螺旋结构的X射线照片MauriceWilkinsPhotographicfilm1953-Franklin&WilkinsDescriptio

3、nofthe3-DstructureofDNAFrancisCrick&JamesWatson三位科学家因为对这一成果的贡献，共享1962年的诺贝尔生物学奖ConservativeModelSemiconservativeModelFrankStahlMattMeselsonParentcellFirstreplicationSecondreplication1958-MatthewMeselson&FranklinStahlprovedthatDNAreplicationinbacteriafollowsthesemiconservativepathway3.50

4、年代末至60年代，相继提出了"中心法则"和操纵子学说,成功地破译了遗传密码，充分认识了遗传信息的流动和表达。JacobandMonod但是，如果没有分离和富集单一DNA分子的技术，科学家就无法对这类物质进行直接的生化分析。两大技术保证：1.DNA的体外切割和连接1962年Arber发现限制性核酸内切酶，1967Gellert发现了DNA连接酶（DNAligase）一把特殊的剪刀—限制性内切酶的发现阿尔伯(Arber)、史密斯(Smith)和内森斯(Nathans)，获1978年诺贝尔生理学和医学奖HerbertBoyer,StanleyCohen1972年获得第一

5、个重组DNA分子(实现不同来源DNA的重组)HerbertBoyer1972-PaulBergProducedfirstrecombinantDNAusingEcoRIEcoRIrecognitionsitesλphageDNAEcoRIcutsDNAintofragmentsStickyendSV40DNAThetwofragmentssticktogetherbybasepairingDNAligaseRecombinantDNA1973-Boyer,Cohen&ChangTransformE.coliwithrecombinantplasmidStanleyC

6、ohen&AnnieChanHerbertBoyerKanamycinresistancegenePlasmidpSC101TetracyclineresistancegeneE.colitransformedwithrecombinantplasmidTransformedcellsplatedontomediumwithkanamycinandtetracyclineOnlycellswithrecombinantplasmidsurvivetoproducecolonies2.DNA的核苷酸序列分析技术DNA核苷酸序列分析法是在核酸的酶学和生物化学的基础上创立

7、并发站起来的一门重要的DNA技术学，这门技术，对于从分子水平上研究基因的结构与功能的关系，以及克隆DNA片断的操作方面，都有着十分广泛的使用价值。Generalprocessofgeneengineering1.从生物有机体基因组中，分离出带有目的基因的DNA片段。2.将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重组DNA分子。3.将重组DNA分子转移到适当的受体细胞（亦称寄主细胞）并与之一起增殖。4.从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞，并筛选出已经得到扩增的目的基因。5.将目的基因克隆到表达载体上