核酸分离和纯化

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1、第三章核酸的分离与纯化张晖医学二系生化与分子生物学教研室BiochemistryDepartmentofZhejiangmedicalcollege第一节主要内容一、材料和方法的选择二、技术路线的设计核酸分离纯化过程三、核酸的鉴定和保存BiochemistryDepartmentofZhejiangmedicalcollege无论是进行核酸结构还是功能研究，首先需要对核酸进行分离和纯化。前言BiochemistryDepartmentofZhejiangmedicalcollege一、材料和方法

2、的选择（掌握）（一）材料的选择BiochemistryDepartmentofZhejiangmedicalcollege2、清除其他分子的污染所用器械和一些试剂需高温灭菌，提取缓冲液中需加核酸酶抑制剂。（二）选择分离方法的原则1、保持核酸碱基序列的完整性BiochemistryDepartmentofZhejiangmedicalcollege（三）保持核酸分子一级结构的完整性1、温度不要过高2、控制pH值范围(pH值5-9)3、避免自身酶对核酸的水解4、减少理化因素对核酸的机械剪切力Bioc

3、hemistryDepartmentofZhejiangmedicalcollege二、技术路线的设计(熟悉)核酸的释放核酸的分离与纯化核酸的浓缩、沉淀步骤越多，纯度越高，得率越低。BiochemistryDepartmentofZhejiangmedicalcollege（一）细胞的破碎（了解）1、高速组织捣碎机捣碎2、超声波处理法BiochemistryDepartmentofZhejiangmedicalcollege3、液氮研磨法4、化学处理法(SDS、LDS，吐温80等）5、生化法（溶

4、菌酶、纤维素酶等）BiochemistryDepartmentofZhejiangmedicalcollege核酸与蛋白质的结合力主要是正负静电吸力(核酸与碱性蛋白的结合)、氢键和非极性的范德华力。分离核酸最困难的是将与核酸紧密结合的蛋白质分开，同时避免核酸降解。（SDS，酚/氯仿抽提）（二）核酸的分离和纯化(了解)BiochemistryDepartmentofZhejiangmedicalcollege（三）核酸的沉淀（了解）优点：①很容易将核酸调整到所需浓度②去除溶液中某些盐离子与杂质沉淀

5、是浓缩核酸最常用的方法。常用的沉淀有机溶剂：乙醇、异丙醇、聚乙二醇BiochemistryDepartmentofZhejiangmedicalcollege三、核酸的鉴定和保存（掌握）（1）紫外分光光度法测DNA和RNA的浓度前提：核酸样品要较纯，无显著蛋白质、酚、琼脂糖及其他核酸污染。测定浓度应大于0.25μg/ml。结论：在波长260nm紫外光下，1OD值的吸光度相当于双链DNA浓度为50μg/ml；单链DNA为37μg/ml；RNA为40ug/ml。（一）核酸的鉴定1.浓度鉴定Bioch

6、emistryDepartmentofZhejiangmedicalcollege（2）荧光光度法（电泳法）原理：荧光染料溴化乙锭(EB)嵌入碱基平面之间后，DNA、RNA在紫外光激发下，可发出红色荧光，荧光强度与核酸含量成正比。BiochemistryDepartmentofZhejiangmedicalcollege2、纯度的鉴定分析1)OD260/OD280大于标准值，表明DNA中有RNA污染。2)OD260/OD280小于标准值，表明样品中存在蛋白质或酚污染；OD260/OD280DNA

7、应为1.8RNA应为2.0（1）DNA和RNA纯度的鉴定(紫外分光法)注：可能出现既含蛋白质又含RNA的DNA溶液，比值为1.8的情况。BiochemistryDepartmentofZhejiangmedicalcollege（2）荧光光度法BiochemistryDepartmentofZhejiangmedicalcollege（二）核酸的保存(2)对RNA样品的保存方法RNA样品溶于0.3mol/LNaAc(pH5.2)或双蒸灭菌水中，-70℃保存;(1)对DNA样品的保存方法DNA样品

8、溶于pH8.0的TE，4℃或-20℃保存BiochemistryDepartmentofZhejiangmedicalcollege思考题？核酸分离纯化的基本步骤和注意事项有哪些？BiochemistryDepartmentofZhejiangmedicalcollege谢谢大家！BiochemistryDepartmentofZhejiangmedicalcollege