核酸分离纯化.ppt

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1、2.基因组DNA的分离与纯化第六章核酸的分离与纯化1.核酸分离纯化的原则4.RNA的分离与纯化主要内容3.质粒DNA的提取与纯化核酸的分类、分布及意义概述核酸分离纯化的意义核酸的存在方式：DNP、RNP核酸的结构特征PaperTowels核酸分离的技术路线1tissueSDSProtKPhenolChloroETOHpptSpin第一节核酸分离与纯化的原则材料与方法的选择原则技术路线的设计核酸的鉴定与保存实验要求：1.质量高:完整性、产量、纯度和浓度符合实验要求；2.方法好：简便快速、安全、经济；3.标本易得:血液、尿液、组织切

2、块、培养的细胞和细菌等。一、材料与方法的选择核酸完整性的保持：1.避免过酸和过碱环境，pH在4-10之间；2.避免高温破坏，0-4C进行；3.简化步骤，缩短时间，减少破坏；4.抑制DNA酶和RNA酶的活性:用EDTA、柠檬酸盐络合Mg2+、Ca2+等离子。二、技术路线的设计核酸的释放：1.细胞破碎方法中机械剪切法不能用于基因组DNA的提取；2.非机械法常用化学试剂或酶细胞溶解法。核酸的分离与纯化：1.除去蛋白质、多糖、脂类等大分子物质；2.除去非目的核酸组分：3.除去实验溶液和试剂：核酸的浓缩、沉淀与洗涤：1.浓缩：提高样品浓度；2.沉淀：

3、常用的浓缩方法，如醋酸钠、醋酸铵等3.洗涤：除去共沉淀的盐，常用70%-75%的乙醇。三、核酸的鉴定与保存浓度鉴定：1.紫外分光光度法：原理：紫外吸收特性粗略定量：1OD相当于50g/ml双链DNA，38g/ml单链DNA或单链RNA，33g/ml单链寡聚核苷酸；准确定量：摩尔消光系数法计算盐溶液的影响：测定A310校正适用浓度：大于0.25g/ml2.荧光光度法：原理：荧光染料溴化乙锭（ethidiumbromideEB）嵌入碱基平面，在紫外光的激发下产生橙红色荧光粗略定量：与分子量标准物对比；准确定量：荧光分光光度计，灵敏度达1-

4、5ng/ml其它荧光染料：SYBRgold，灵敏度达20pg/ml；SYBRGreenI等适用浓度：大于0.25g/ml纯度鉴定：1.紫外分光光度法：原理：蛋白质和核酸紫外吸收特性的差异纯度鉴定：1.紫外分光光度法：原理：蛋白质和核酸紫外吸收特性的差异纯DNA：A260/A280=1.8，纯RNA：A260/A280=2.0；比值降低：蛋白质污染（280）、酚污染（270）比值升高：DNA变性、RNA污染混合污染：比值正常缓冲液的影响：在TE缓冲液和水、Tris等缓冲液中的比值有变化，应注意校正。核酸的紫外吸收特性2202402602803

5、00消光系数A260A280=1.6-1.8AGCTU核酸的最大吸收峰在=260nm蛋白质的最大吸收峰在=280nm酚的最大吸收峰在=270nm纯度鉴定1.紫外法：蛋白质和核酸紫外吸收特性的差异2.荧光光度法：原理：凝胶电泳观察图谱RNA电泳图谱：原核生物5S、16S、23S三条带；真核生物：5S和5.8S、18S、28S三条带；DNA分子大，迁移率小完整性鉴定：1.凝胶电泳法：根据电泳条带的数目、位置和形状判定RNA分子可以通过荧光强度积分来判定有无降解。2.其它方法：逆转录法、核酸杂交、芯片检测等。SampleWell25ng1kb

6、ladder0.8%Agarose124681012kbAgaroseGelElectrophoresisSybergoldDetectionLimit:~0.2-0.5ngDNAEtBrDetectionLimit:~5-10ngDNAResultsofSouthernBlotControlTissueCancerTissueBRCA3EcoRIEcoRI核酸的保存：1.DNA的保存：-70C，TE缓冲液中数年，加入氯仿可防止污染原理：2.RNA的保存：-70C，醋酸钠溶液或焦碳酸二乙酯（DEPC）溶液中，较长期保存。第二节基因组DNA

7、的分离与纯化基因组DNA的特点：1.分子大，容易断裂2.容易污染其它来源的DNA分离纯化方法：1.酚抽提法2.甲酰胺解聚法3.玻棒缠绕法4.异丙醇沉淀法基因组DNA分离纯化技术路线生物体组织细胞裂解酚抽提法玻棒缠绕法甲酰胺解聚法DNA粗制品电泳分离特定DNA片段盐析法沉淀有机溶剂抽提法乙醇沉淀洗涤基因组DNA纯品凝胶中特定DNA片段酚抽提法tissueSDSProtKPhenolChloroETOHpptSpinDNA样品的纯化：1.分子大，容易断裂2.容易污染其它来源的DNA纯化方法：1.透析2.层析3.选择性沉淀4.凝胶电泳Agarose

8、GelElectrophoresis_+3片段回收回收方法：1.DEAE纤维素膜插片电泳2.转膜电泳法、透析袋电泳法3.凝胶洗脱法4.冷冻挤压法5.低熔点琼脂糖凝胶