《核酸分离纯化技术》PPT课件

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1、基因诊断技术基因诊断(genediagnosis)是利用分子生物学及分子遗传的技术和原理，在DNA水平分析基因的存在、鉴定疾病所涉及基因的置换、缺失或插入等突变，以诊断各种感染性疾病和遗传性疾病，进行肿瘤分子水平的研究。主要技术及过程区分或鉴定DNA的异常分离、扩增待测的DNA片断基因探针的制备和标记基因诊断的特点:高度的特异性高度的灵敏性实现早期快速诊断被检测基因不一定活化，可检测表达差异基因。基本技术：（一）核酸分子杂交（二）聚合酶链反应（PCR）（三）单链构象多态性检测（四）限制酶酶谱分析（五）DNA

2、序列测定（六）DNA芯片技术第一节核酸的分离与纯化意义：实验的第一步工作，实验结果的基本保障原则：保证一级结构的完整性排除其它大分子的污染要求：1.不能存在对核酸结构功能有影响的物质2.降低蛋白、多糖、脂类分子污染一、首先了解核酸的存在状态及分布：形状：真核生物染色体DNA是双链线状，其细胞器DNA以及原核生物DNA，质粒DNA等都是双链环状。多数生物体的RNA分子是单链线状。而且，不同类型的RNA还有不同的结构特点。如真核生物mRNA多数有PolyA尾巴。至于病毒、类病毒所含的DNA和RNA分子则形式多样

3、，有双链线状、双链环状、单链线状、单链环状等。无论DNA还是RNA，在体内都形成一定的高级结构。分布：真核生物的DNA主要存在于细胞核中，只有约5%在线粒体、叶绿体等细胞器中。RNA则75%左右存在于细胞质中，约15%在细胞器中，约10%在核中。原核生物DNA集中在核质区，RNA分散在细胞质里。细胞质各种RNA中，以rRNA的数量最多（约占5%），tRNA其次（15-20%），mRNA最少（1-5%）。油菜叶片总RNA的非变性电泳（A）和甲醛变性电泳（B）结果二．分离纯化核酸时的注意事项要得到具有生物活性的

4、核酸大分子，在分离时必须避免核酸变性，并尽可能保持分子的完整性，避免降解。因此，要注意下列事项：１.尽量简化操作步骤，缩短提取过程，以减少变性降解的机会。２.减少化学因素对核酸的降解ＰＨ４－１０，避免酸碱对核酸的磷酸二脂键的破坏3,5-磷酸二酯键温度：最适温度　４℃防止机械剪切力的作用：基因组DNA：分子细长，容易受到机械剪切力的作用而断裂，所以机械剪切作用是分离DNA时的主要危险。３.减少物理因素对核酸的降解操作时动作必须轻缓，搅拌时要温和，避免让DNA溶液通过狭窄的孔道。在提取缓冲液中加入蔗糖或山梨

5、糖醇等增加溶液的渗透压。提取分子量较小，结构又很紧密的DNA，如小的细菌质粒超螺旋DNA等时，机械剪切力的威胁较小，操作时可不必过于谨慎核酸酶直接破坏核酸一级结构，必须抑制其活性对于DNA酶：大多数DNA酶作用时需要二价金属离子，如Ca2+,Mg2+等。因此只要加入EDTA（乙二胺四乙酸），螯合剂就可以基本上抑制DNA酶的活力。４.防止核酸的生物降解无所不在的RNA酶：外源性RNA酶：RNA制备过程中用到的玻璃和塑料制品、研究人员本身尤其是研究人员的手，以及分离过程中用到的试剂和溶液。内源性RNA酶：组织本

6、身所固有的，在某些组织中（如胰腺），或者在其特定的生理状态（如快速发育期间）下的含量很高。而且一当细胞破碎后即释放出来。对于RNA酶：其具有高稳定性，抗酸抗碱，具很广的pH作用范围，抗高温严寒（0~65℃均具有活性）。而该酶作用时不需要二价金属离子，故用螯合剂无法抑制其活力。三．核酸的分离提取大致步骤：１.收集细胞２.破碎裂解细胞（或细胞器）３.解聚核蛋白并去除蛋白质４.沉淀核酸并去除其他杂质（纯化）。（一）破碎细胞1．机械破碎法通过机械运动所产生的剪切力的作用使细胞破碎的方法，称为机械破碎法。2．物理破碎

7、法通过温度、压力、声波等各种物理因素的作用使组织细胞破碎的方法，称为物理破碎法。物理破碎法多用于微生物细胞的破碎。常用的物理破碎方法有：①温度差破碎法：利用温度的突然变化，细胞由于热胀冷缩的作用而破碎。该法简单易行，但效率不高，需反复几次才能达到预期的效果。②压力差破碎法：通过压力的突然变化，使细胞破碎。常用的有高压冲击、突然降压及渗透压变化等方法。如红血球在纯水中会发生破壁溶血现象。③超声波法：超声波是破碎细胞或细胞器的一种有效手段，且一次处理的量较大。该方法的主要缺陷是超声空穴局部过热引起的生物大分子的

8、变性，所以超声振荡处理的时间应尽可能短，容器周围以冰浴冷却处理，尽量减小热效应引起的酶的失活。３.化学破碎法通过各种化学试剂对细胞膜的作用使细胞破碎的方法，称为化学破碎法。常用的化学试剂有甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等有机溶剂和Triton，Tween等表面活性剂。４.酶促破碎法通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎的目的。（二）核蛋白的解聚和蛋白质的去除1．酚抽提法酚和氯仿是