核酸的分离与纯化ppt课件.ppt

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1、核酸的分离与纯化核酸的分离主要是指将核酸与蛋白质、多糖、脂肪等生物大分子分开。在分离核酸时，应遵循两个原则：一是保证核酸一级结构的完整性；二是尽量排除其它分子的污染，保证核酸样品的纯度。2021/8/92核酸分离与纯化的过程一般都包括了材料的选择、核酸的释放、核酸与其它生物大分子的分离、核酸的纯化与鉴定、核酸的浓缩、保存等几个主要步骤。每一步骤又可由多种不同的方法单独或联合实现。2021/8/93一、材料的选择临床常见的标本血液、组织及体外培养的细胞等都可作为提取核酸的原料，具体实验材料的选择应根据实验的目的来确定。2021/8/94二、核酸的释放（一）机械法包括低渗裂解、超声

2、裂解、微波裂解、冻融裂解和颗粒破碎等物理裂解方法。这些方法用机械力使细胞破碎，但机械力也可引起高分子量线性分子的断裂，因而不适用于染色体DNA的分离纯化。2021/8/95（二）化学法在一定的pH环境下，加入表面活性剂或强离子剂使细胞裂解，蛋白质和多糖沉淀，核酸被从细胞内释放出来。向缓冲液中加入一些金属离子螯合剂抑制核酸酶的活性，保护核酸不被降解。2021/8/96（三）酶法通过加入溶菌酶或蛋白酶（如蛋白酶K）使细胞破裂，核酸释放。蛋白酶还能降解与核酸结合的蛋白质，促进核酸的分离。溶菌酶能催化细菌细胞壁的蛋白多糖N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸残基间的β-1,4键水解。蛋白酶K能

3、催化水解多种肽键，且在65℃及有EDTA、尿素和去垢剂如0.5%SDS或1%TritonX-100存在时仍保留有酶活性，对于高分子量核酸的提取有很大的优势。2021/8/97三、核酸的分离与纯化（一）核酸分离纯化的基本方法1.酚抽提法细胞裂解后离心分离含核酸的水相，加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇混合液，混匀后离心分离。蛋白质被分配至有机相，核酸则被留于上层水相。在含核酸的水相中加入醋酸钾或醋酸钠，形成核酸盐，核酸盐可被一些有机溶剂沉淀，离心得到的核酸可以用70%乙醇洗涤以除去多余的盐分，即可获得一定纯度的核酸。2021/8/9102.层析法包括吸附层析、亲和层析、离子交换层析等。

4、因分离和纯化同步进行，并且有商品试剂盒供应而被广泛应用于核酸的纯化。在一定的离子环境下，核酸可被选择性地吸附到硅土、硅胶或玻璃表面而与其他生物分子分离。2021/8/9113.密度梯度离心法双链DNA、单链DNA、RNA和蛋白质具有不同的密度，因而可经密度梯度离心的方法形成不同密度的纯样品区带，该法适用于大量核酸样本的制备。2021/8/912氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心法是纯化大量质粒DNA的首选方法。氯化铯是核酸密度梯度离心的标准介质，梯度液中的溴化乙锭与核酸结合，离心后形成的核酸区带经紫外灯照射产生荧光而被检测。用注射针头穿刺回收后，通过透析或乙醇沉淀除去氯化铯而获得纯化

5、的核酸。2021/8/913（二）基因组DNA的分离纯化生物体组织细胞玻棒缠绕法酚抽提法基因组DNA粗品PFGE分离特定的DNA片段AGE分离PAGE分离乙醇沉淀洗涤基因组DNA纯品精分离粗分离前处理离子交换层析纯化有机溶剂抽提细胞裂解蛋白质变性沉淀降解DNA释放甲酰胺解聚法哺乳动物基因组DNA分离纯化的一般技术路线1.酚抽提法以含EDTA、SDS及无DNA酶的RNA酶裂解缓冲液裂解细胞，经蛋白酶K处理后，用pH8.0的Tris饱和酚抽提DNA，重复抽提至一定纯度后，根据不同需要行透析或沉淀处理，获得所需的DNA样品。2021/8/916DNA酚抽提法示意图一、酚抽提法2021

6、/8/917主要试剂的作用：EDTA：二价金属螯合剂，抑制核酸酶；降低细胞膜的稳定性2021/8/918SDS的作用：溶解膜蛋白和脂肪，从而使细胞膜破裂；溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸释放出来；对RNA、DNA酶有抑制作用；与蛋白质形成复合物，使蛋白质变性。2021/8/919蛋白酶K：水解蛋白质的作用，消化DNA酶和细胞中的蛋白质。蛋白酶K与其他蛋白酶相比，它具有更强的水解能力，而且在SDS、EDTA存在时仍保持较高活性，可同时使用。2021/8/920酚可以使蛋白质变性沉淀、抑制DNA酶活性。PH8.0的Tris溶液可以使得抽提出的DNA进入水相，减少在蛋白质层滞留。在

7、酚或酚-氯仿中加入少许的异戊醇，是可以减少实验中的气泡的产生，而且利于分相，保持分相的稳定性。2021/8/921为什么苯酚要重蒸饱和后才能用于DNA的分离？苯酚在空气中经常被氧化生成醌，它能够产生自由基，如果直接用于DNA分离，会使磷酸二酯键断裂，造成DNA降解。氧化苯酚需要经过高温重蒸以除去氧化物，并用Tris-Hcl饱和酚，并调节至中性。使用饱和酚可以减少酚吸收更多的DNA，降低DNA的损失率。2021/8/9222.甲酰胺解聚法细胞裂解与蛋白质水解同酚抽提法相似，但不进行酚的抽提，而