核酸的分离纯化ppt课件.ppt

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1、第二章核酸的分离纯化DNA和RNA是生物体中最重要的核酸分子，是分子生物学和分子诊断的研究对象DNA和RNA的分离纯化是分子生物学研究及分子诊断最基础的工作核酸分离纯化的原则:保持核酸一级结构的完整性尽可能提高核酸制品的纯度核酸分子提取的技术路线I.材料准备II.破碎细胞或包膜－内容物释放III.核酸分离、纯化IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质V.核酸溶解在适量缓冲液或水中第一节核酸分离纯化的设计及原则第二节基因组DNA的分离纯化第三节质粒DNA的提取与纯化第四节RNA的分离纯化第五节核酸的保存与鉴定第一节核酸分离纯化的设计及原则一、材料与方法的选择二、技术路线的设计三、核

2、酸的鉴定与保存（一）材料与方法的选择不同的研究目的对核酸的完整性、纯度、产量及浓度有不同的要求。需考虑制备核酸所需的时间与成本应选择安全的试剂与制备方案一、材料与方法的选择1.保持核酸碱基序列的完整性2.尽量清除其它分子的污染，保证核酸纯度3.保持核酸的完整性尽量简化分离纯化步骤，缩短提取时间尽量避免各种有害因素对核酸的破坏（二）选择原则一、材料与方法的选择二、技术路线的设计（一）核酸的释放（二）核酸的分离与纯化（三）核酸的浓缩、沉淀与洗涤（一）核酸的释放DNA和RNA均位于细胞内（病毒除外），因此核酸分离与纯化的第一步即是裂解细胞、释放核酸。应该清除的杂质主要包括:1.

3、非核酸的大分子污染物蛋白质、多糖及脂类物质等2.非需要的核酸分子分离某一核酸分子时，其它核酸皆为杂质3.加入的有机溶剂和某些金属离子（二）核酸的分离与纯化（三）核酸的浓缩、沉淀与洗涤沉淀是浓缩核酸最常用的方法常用的盐类:醋酸钠、醋酸钾、醋酸铵、氯化钠、氯化钾及氯化镁常用的有机溶剂:乙醇、异丙醇和聚乙二醇核酸沉淀常常含有少量共沉淀的盐，需用70%～75%的乙醇洗涤去除三、核酸的鉴定与保存（一）核酸的鉴定（二）核酸的保存（一）核酸的鉴定1.浓度鉴定2.纯度鉴定3.完整性鉴定紫外分光光度法：核酸分子中的碱基具有共轭双键结构，可以吸收紫外线，其最大吸收波长为260nm。1.浓度鉴

4、定各种碱基的紫外吸收光谱荧光光度法：核酸的荧光染料溴化乙锭嵌入碱基平面后，本身无荧光的核酸在UV激发下发出红色荧光。荧光强度的积分与溶液中核酸的含量呈正比。EB与DNA的结合紫外分光光度法：主要通过A260与A280的比值来判定有无蛋白质的污染。比值升高或降低均提示制备的核酸纯度不佳。2.纯度鉴定1.DNA或RNA的定量OD260=1.0相当于50μg/ml双链DNA40μg/ml单链DNA（或RNA）20μg/ml寡核苷酸2.判断核酸样品的纯度DNA纯品:OD260/OD280=1.8RNA纯品:OD260/OD280=2.0荧光光度法：EB等荧光染料示踪的核酸电泳可判

5、定核酸制品的纯度。琼脂糖凝胶电泳：以EB为示踪剂的核酸凝胶电泳可判定核酸制品的完整性基因组DNA如果发生降解，电泳图呈拖尾状3.完整性鉴定DNA的降解完整的或降解很少的总RNA电泳图谱中，三条带荧光强度应呈特定的比值。沉降系数大，电泳迁移率低，荧光强度高沉降系数小，电泳迁移率高，荧光强度低28S（或23S）RNA的荧光强度一般约为18S（或16S）RNA的2倍，否则提示有RNA的降解若在点样孔附近有着色条带，提示可能存在DNA的污染（二）核酸的保存1.DNA的储存2.RNA的储存溶于TE缓冲液中的DNA在-70℃冰箱可保存数年。TE的pH为8.0时，DNA的脱氨反应减少，

6、pH低7.0时DNA易变性。1.DNA的保存2.RNA的保存RNA溶于H2O或0.3mol/L的NaAc溶液中，-70℃保存RNA溶液中加入RNasin或VRC，可延长保存时间用于配置试剂及溶解RNA的H2O均应经DEPC处理第二节真核基因组DNA的分离纯化生物体组织细胞玻棒缠绕法酚抽提法基因组DNA粗品PFGE分离特定的DNA片段AGE分离PAGE分离乙醇沉淀洗涤基因组DNA纯品精分离粗分离前处理离子交换层析纯化有机溶剂抽提细胞裂解蛋白质变性沉淀降解DNA释放甲酰胺解聚法哺乳动物基因组DNA分离纯化的一般技术路线基因组DNA的提取---酚抽提法样品的准备细胞的裂解蛋白质

7、变性DNA的抽提DNA的沉淀血基因组DNA试剂盒酵母基因组DNA试剂盒细菌基因组DNA试剂盒细胞基因组DNA试剂盒一、酚抽提法二、甲酰胺解聚法三、玻棒缠绕法四、其它方法五、DNA片段的纯化六、DNA片段的回收一、酚抽提法1976年由Stafford及其同事创立，现在使用的是改进的方法以含EDTA、SDS及RNase的裂解缓冲液裂解细胞经蛋白酶K处理后，用pH8.0的Tris饱和酚抽提，获得DNA粗制品二、甲酰胺解聚法1987年Kupiec等报道了甲酰胺解聚法，其中细胞裂解和蛋白质水解步骤同酚抽提法，但不进行酚的抽提。三、玻棒缠