实验25-氮蓝四唑(NBT)法测定超氧化物歧化酶活力.doc

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1、氮蓝四唑(NBT)法测定超氧化物歧化酶活力一、原理超氧化物歧化酶（superoxidedismutase,SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶，它催化下列反应：本反应产物H2O2可由过氧化氢酶进一步分解或被过氧化物酶利用。本实验依据超氧化物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生超氧阴离子自由基，超氧阴离子自由基可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。而SOD可清除超氧阴离子自由基，从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色

2、愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。二、材料、仪器设备及试剂（一）材料水稻或小麦叶片。（二）仪器设备高速台式离心机，分光光度计，微量进样器，荧光灯（反应试管处照度为4000lx），试管或指形管数支。（三）试剂（1）0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）。（2）130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液称1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100ml。（3）750µmol/L氮蓝四唑溶液称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存。（4）100µmol/LEDTA-Na2溶液称取0.03721gEDTA-Na2，用磷酸缓冲液定容

3、至1000ml。（5）20µmol/L核黄素溶液称取0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml，避光保存。三、实验步骤1、酶液提取取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g于预冷的研钵中，加1ml预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使终体积为5ml。取1.5－2ml于4000r/min下离心10min，上清液即为SOD粗提液。2、显色反应取5ml指形管（要求透明度好）4支，2支为测定管，另2支为对照管，按下表加入各种溶液：各溶液显色反应用量试剂（酶）用量/ml终浓度（比色时）0.05mol/L1.5130mmol/L0.313mmol/L750umol/L0.3

4、75umol/L100umol/L0.310umol/L20umol/L0.32.0umol/L酶液0.052支对照管以缓冲溶液代替酶液蒸馏水0.25总体积3.0混匀后将1支对照管置暗处，其他各管于4000lx日光下反应20min（要求各管受光情况一致，温度高，时间缩短，低时延长）。3、SOD活性测定至反应结束后，以不照光的对照管作空白，分别测定其他各管的吸光度。四、结果计算已知SOD活性单位以抑制NBT光还原的50％为一个酶活性单位表示，按下式计算SOD活性。SOD总活性＝式中：SOD总活性以每克样品鲜质量的酶单位表示（U/g）；Ack为照光对照管的吸光度；AE为样品管的吸光

5、度；V为样品液总体积(ml);Vt为测定时样品用量(ml)；W为样鲜重(g)。