氮蓝四唑(nbt)法测定超氧化物歧化酶(sod)活性

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1、实验三氮蓝四唑(NBT)法测定超氧化物歧化酶(SOD)活性一、实验目的1、了解氮蓝四唑(NBT)法测定植物体内超氧化物歧化酶(SOD)活性的基本原理。2、掌握氮蓝四唑(NBT)法测定植物体内超氧化物歧化酶(SOD)活性的基本操作方法。二、实验原理超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)普遍存在于动、植物体内,是一种清除超氧阴离子自由基的酶。本实验依据超氧化物歧化酶抑制氮蓝四唑(NBT)在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有氧化物质存在下,核黄素可被光还原,被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生超氧阴离子自由基,超氧阴离子自由基可将氮蓝四唑还原为蓝

2、色的甲腙,后者在560nm处有最大吸收。而SOD可清除超氧阴离子自由基,从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后,反应液蓝色愈深,说明酶活性愈低,反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。三、材料、仪器设备及试剂(一)材料水稻或小麦等植物叶片。(二)仪器设备高速台式离心机,分光光度计,微量进样器,荧光灯(反应试管处照度为4000Lx),试管或指形管数支。(三)试剂(1)0.05mol/L磷酸缓冲液(pH7.8)。91.5ml0.05MNa2HPO4+8.5ml0.05MNaH2PO4。(2)130mmol/L甲硫氨酸(Met)溶液:称1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至10

3、0ml。(3)750µmol/L氮蓝四唑溶液:称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml,避光保存。20(4)100µmol/LEDTA-Na2溶液:称取0.03721gEDTA-Na2,用磷酸缓冲液定容至1000ml。(5)20µmol/L核黄素溶液:称取0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml,避光保存。四、实验步骤1、酶液提取取一定部位的植物叶片(视需要定,去叶脉)0.52g于预冷的研钵中,加1ml预冷的磷酸缓液在冰浴上研磨成浆,加缓冲液使终体积为4ml。取4ml于4℃10000r/min离心20min上清液即为SOD粗提液。2、显色反应取10mL试

4、管(要求透明度好)4支,2支为测定管,另2支为对照管,按下表加入各种溶液:各溶液显色反应用量混匀后将1支对照管置暗处,其他各管于4000lx日光下反应20min(要各管受光情况一致,温度高,时间缩短,低时延长)。3、SOD活性测定与计算至反应结束后,全部移入暗处,以不照光的对照管作空白,分别测定其他各管的吸光度。注意:用放在暗处的缓冲液代替酶液的空白管调零,各试剂按比例混合好(3.5ml缓冲液+0.5ml甲硫氨酸+0.5ml氮蓝四唑+0.5mlEDTANa2+0.40ml蒸馏水),再加100ul酶液,核黄素0.5ml最后单独加入。总体积6.0mL表10SOD活性测定的试剂量

5、试管编号1对照(不光照)2对照(光照)34缓冲液(mL)3.503.503.503.50甲硫氨酸(mL)0.500.500.500.50氮蓝四唑(mL)0.500.500.500.5020EDTANa2(mL)0.500.500.500.50蒸馏水(mL)0.500.500.400.40酶液000.100.10核黄素0.500.500.500.50测定结果0AckAE1AE2表11SOD活性测定(平行测定2次)的Abs试管号2对照(光照)34平行测定次数第一次第二次第一次第二次第一次第二次吸光度A(Abs)0.2030.2510.0550.1990.0350.140五、结果

6、计算计算公式:SOD(U/g.FW)=(Ack-AE)*VT/Ack/0.5/W/Vs式中VT-总酶液量(ml)Vs-所用酶液量(50ul)W-叶片鲜重(g)Ack-用缓冲液代替酶液的照光对照管吸光度AE-样品管吸光度表12SOD活性的计算VT=400uLVs=50uLW=0.52g平行侧定次数第一次第二次样品管管号3434SOD(U/g.FW)0.2240.2550.0640.136六、实验结果分析讨论20总黄酮生物总黄酮是指黄酮类化合物,是一大类天然产物,广泛存在于植物界,是许多中草药的有效成分。在自然界中最常见的是黄酮和黄酮醇,其它包括双氢黄(醇)、异黄酮、双黄酮、黄

7、烷醇、查尔酮、橙酮、花色苷及新黄酮类等。简介  近年来,由于自由基生命科学的进展,使具有很强的抗氧化和消除自由基作用的类黄酮受到空前的重视。类黄酮参与了磷酸与花生四烯酸的代谢、蛋白质的磷酸化、钙离子的转移、自由基的清除、抗氧化活力的增强、氧化还原作用、螯合作用和基因的表达。它们对健康的好处有:(1)抗炎症(2)抗过敏(3)抑制细菌(4)抑制寄生虫(5)抑制病毒(6)防治肝病(7)防治血管疾病(8)防治血管栓塞(9)防治心与脑血管疾病(10)抗肿瘤(11)抗化学毒物等。天然来源的生物黄酮分子量小,能被人体迅速吸收,能

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