超氧化物歧化酶(SOD)活性测定

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1、超氧化物歧化酶(SOD)活性测定(NBT法)一、测定意义二、目的要求三、原理四、仪器设备五、试剂配制六、植物材料七、操作步骤八、结果计算九、注意事项十、思考题一、意义：细胞内自由基的产生和消除处于动态平衡状态，自由基水平很低，不会伤害细胞。植物正常情况下植物逆境胁迫下O-.2、H2O2、OH·的产量增加；SOD、CAT、POD活性降低；VtE、VtC、CAR、GSH含量降低；从而伤害细胞。植物体内活性氧代谢系统的平衡被打破什么叫逆境？逆境是指对植物生存生长不利的各种环境因素的总称.逆境的种类?为什么要测定完全液和缺素苗的SOD活性？二、目的要求：1.了解SO

2、D活力测定的实践意义；2.掌握SOD测定的原理及操作要点；3.比较完全液溶液和缺素溶液培养的玉米苗叶片SOD活性的差异。三、原理：三、原理：依据SOD能抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O2.-，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。而SOD可清除O2.-，从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。四、仪器设备研钵；玻璃试管;40W荧光灯;移液管等。五、试剂配制1、提

3、取介质─50mmol/L(pH7.0)磷酸缓冲液。2、反应介质─50mmol/L(pH7.8)磷酸缓冲液,内含77.12μmol/L硝基四唑蓝,0.1mmol/LEDTA,13.37mmol/L蛋氨酸。3、80.2μmol/L核黄素溶液:用含有0.1mmol/LEDTA的50mmol/L(pH7.8)的磷酸缓冲液配制。SOD反应混合液3.9ml反应介质0.1ml80.2μmol/L核黄素溶液六、植物材料:玉米叶片:完全液培养苗缺素液培养苗七、操作步骤将玉米叶片剪细─→混合均匀→称0.2g(用保鲜膜包好放低温冰箱预冻)→研磨成匀浆→再加入3ml缓冲液,研磨均匀后

4、,将匀浆液倒入聚乙烯离心管中→低温(0～4℃)下、4800rpm离心10min─→上清液即为酶液，将上清液倒入小青霉瓶，低温下贮存，供SOD活性测定。1、酶液的提取：加入2ml冰冷的0.05mol/LpH7.0磷酸缓冲液及少量的石英砂研钵2.SOD活性测定：取6支试管,编号,按下表加入试剂。将1号管用黑纸袋套上,与其它试管一起放荧光灯下,光强3000Lx照光10min,到时间后关灯,用黑布罩上试管(如室内光线不强,不罩黑布也可),以1号试管溶液为参比,测定样品在560nm处的吸光度。不加酶的2号试管溶液颜色最深;加入酶的由于SOD抑制了硝基四唑蓝的光还原,颜色

5、变浅。2、活性测定：取6支干燥的、玻璃质量一致的普通试管，按下表顺序加入试剂试管编号123456参比对照管正常叶片缺素叶片酶液100μl100μl100μl100μl提取介质(磷酸缓冲液)100μl100μlSOD反应混合液(含核黄素)4ml4ml4ml4ml4ml4ml各管要充分摇均匀放暗处置于光强3000Lx照光10min560nm吸光值？式中：Ack为2号对照管溶液在560nm处的吸光度值;AE为样品测定管溶液在560nm处的吸光值;V为酶液总体积（ml)；W为提取酶液的植物材料的鲜重（g)；Vt为测定时酶液的用量(ml)。八、结果计算：（Ack-AE)

6、×VSOD活性(U/g鲜重)＝───────────Ack×W×Vt×50％一个酶活单位定义为将硝基四唑蓝的还原抑制到对照一半(50％)时所需的酶量。九、注意事项:1.所用试管的玻璃质量要一样。包括厚度、直径、质量等。2.照光条件要一致。照光时试管放的高度、背景等。3.要多做对照消除日光灯管的光质差异。4.植物组织中的酚类物质对测定有干扰，对酚类含量高的材料提取酶液时可加入聚乙烯吡咯烷酮消除。5.结果计算时要用相邻对照管代入公式计算。十、思考题:1.在SOD活性测定中为什么设照光和暗中两个对照管。2.影响本实验准确性的主要因素是什么？应如何克服？1.下次实验：

7、改良半叶法测定植物光合速率2.请按《植物生理生化实验B》补充材料认真书写预习报告！3.实验适宜时间：晴天上午8~9点开始。具体时间要看气候，如果本周日晴天，就先测定光合速率，“叶绿体色素定量测定”可以调到下周上。请转告今晚请假的同学。柯2011.5.6通知：