大蒜中sod活性测定

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1、大蒜中SOD活性的测定一、实验目的：（1）掌握SOD酶的提取、分离、检测一般步骤。（2）了解酶在提取过程中的两个参数：回收率、纯化倍数。（3）掌握离心机的使用。二、实验原理:邻苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化，释放出O2-，生成带色的中间产物，中间物的积累在滞留30～45s后，与时间成线性关系，一般线性时间维持在4min的范围内，中间物在420nm波长处有强烈光吸收。当有SOD存在时，由于它能催化O2-与H+结合生成O2和H2O2，从而阻止了中间产物的积累，因此，通过测定光吸收即可求出SOD的酶活性。三、实验试剂：大蒜、冷丙酮、磷酸缓冲液（PH7.8，0.

2、05mol/L)、氯仿-乙醇混合液、邻苯三酚、浓盐酸、天平、石英砂、研钵、冷冻离心机、50mL离心管8个、紫外-可见分光光度计、250mL三角瓶8个、玻璃棒8根、试剂瓶250mL3个、500mL3个、250mL烧杯16个、试管带胶塞80根、移液管各5根四、实验步骤：（1）SOD提取：称取5g大蒜蒜瓣，加入石英砂研磨破碎细胞，加入15mL的PH7.80.05mol/L的磷酸缓冲液，研磨搅拌20分钟，使SOD充分溶解，6000rpm离心，弃去沉淀，得上清液。(留出1mL备用，准确量取剩余上清液体积，记录)（2）除杂蛋白：提取液加入1/4体积的氯仿-乙醇混合液搅

3、拌10min，6000rpm离心15min去沉淀，得粗酶液。（取1mL粗酶液备用,精确测量剩余粗酶液体积）（3）SOD酶的沉淀分离：剩余的粗酶液中加入等体积的冷丙酮，搅拌15min，6000rpm离心15min，得到SOD酶沉淀。将沉淀先加2mL磷酸缓冲液，溶解后再加3mL混匀。6000rpm离心15min，取上清得到SOD酶液。取1mL备用，其余量取体积。（4）粗酶液活性测定：提取液、粗酶液、酶液中SOD活力检测，具体步骤如下。加入邻苯三酚后迅速混匀，准确计时4min，加一滴浓盐酸停止反应，420nm测吸光值。试剂/（mL）空白管对照管OD1提取液OD2

4、粗酶液OD2酶液OD2PH8.3缓冲液33333SOD提取液000.10.10.1蒸馏水21.81.71.71.7室温放置20min邻苯三酚00.20.20.20.2（5）溶液中可溶性蛋白含量测定：分别从1mL备用的提取液、粗酶液、酶液各取0.3mL按以下倍数稀释，260nm/280nm测定吸光值，按公式计算蛋白质浓度。提取液稀释：50×粗酶液稀释：20×酶液稀释：10×五、实验数据：提取液粗酶液酶液总体积（ml）提取液粗酶液酶液260nm吸光度值280nm吸光度值公式蛋白质浓度(mg/ml)=(1.45A280－0.74A260)×稀释倍数蛋白质浓度（m

5、g/ml）对照管（OD1）提取液（OD2）粗酶液（OD2）酶液（OD2）420nm吸光值六、实验结果及数据处理：（1）酶活力单位提取液酶活力单位：=2（OD1-OD2）×5/0.1=粗酶液活力单位：=2（OD1-OD2）×5/0.1=酶液活力单位：=2（OD1-OD2）×5/0.1=（2）总活力提取液总活力U=活力单位×总体积=粗酶液总活力=活力单位×总体积=酶液总活力=活力单位×总体积=（3）比活力提取液酶液比活力U/mg=活力单位/蛋白质浓度=粗酶液比活力U/mg=活力单位/蛋白质浓度=酶液比活力U/mg=活力单位/蛋白质浓度=（4）纯化倍数粗酶液纯化

6、倍数=粗酶液比活力/提取液比活力=酶液纯化倍数=酶液比活力/提取液比活力=（5）回收率粗酶液回收率=粗酶液总活力/提取液总活力=酶液回收率=酶液总活力/提取液总活力=七、实验结果误差分析：（1）研磨和离心大概还不够充分。（2）由于测量仪器的精密度引起的误差。（3）在操作的过程中，加入邻苯三酚后未混合均匀，可能致使化学反应进行得不很充分，这可能是造成实验数据与预期不符的一个原因；（4）在实验过程中，所需化学试剂加入的量不是很准确，这可能是实验数据出现问题的另一个原因；（5）此外，实验本身还很粗糙，酶的提取、分离和纯化都不能十分彻底，还有很多杂蛋白干扰实验。氮

7、蓝四唑（NBT）法测定超氧物歧化酶（SOD）活力一、原理超氧物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶。本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O2，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。而SOD可清除O2，从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。