大蒜细胞SOD酶的提取分离与活性测定.doc

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1、大蒜细胞SOD酶的提取分离与活性测定目的1．掌握SOD酶的提取、分离、检测一般步骤。2．了解酶在提取过程中的两个参数：回收率、纯化倍数。试剂大蒜，磷酸缓冲液（PH7.8,0.05mol/l)(PH8.3)，氯仿—乙醇混合液冷丙酮，邻苯三酚，浓盐酸 方法1．SOD提取：称取5g大蒜蒜瓣,加入石英砂研磨破碎细胞，加入15mlPH7.8、0.05mol/L的磷酸缓冲液，研磨搅拌20分钟，使SOD充分溶解，6000rpm离心，弃去沉淀，得上清液。(留出1ml备用,准确量取剩余上清液体积,记录)2.除杂蛋白：提取液加入1/4体积的氯仿－乙

2、醇混合液搅拌10分钟，6000rpm离心15min去沉淀，得粗酶液。（取1ml粗酶液备用,精确测量剩余粗酶液体积）3.SOD酶的沉淀分离：剩余的粗酶液中加入等体积的冷丙酮，搅拌15min，6000rpm离心15min，得到SOD酶沉淀。将沉淀先加2ml磷酸缓冲液，溶解后在加3ml混匀。6000rpm离心15min，取上清得到SOD酶液。取1ml备用，其余量取体积。2. 大蒜SOD的提取液活性测定提取液、粗酶液、酶液中SOD活力检测，1）溶液中可溶性蛋白含量测定：分别从1ml备用的提取液、粗酶液、酶液各取0.3ml按以下倍数稀释,

3、260nm/280nm测定吸光值,按公式计算蛋白质浓度.提取液稀释:50×粗酶液稀释:20×酶液稀释:10× 蛋白质浓度(mg/ml)=(1.45A280–0.74A260)×稀释倍数 计算酶活力单位U/ml=2（OD1-OD2）×5/0.1(1ml反应液中,每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达到80%时的酶量)总活力U=活力单位×总体积比活力U/mg=活力单位/蛋白质浓度纯化倍数=粗酶液(酶液)比活力/提取液比活力回收率=粗酶液(酶液)总活力/提取液总活力 试验结果记录：1） 试剂管  OD1OD2空白管对照管提取液粗酶液酶液光吸收

4、值（A）00.0810.0410.0680.0132）蛋白质含量的测定： 提取液粗酶液酶液光吸收值(A)（260nm）0.4350.7600.185光吸收值(A)（280nm）0.3060.5100.144 3）提取液：酶活力单位U/ml=4.0总活力U=41.2蛋白质浓度（mg/ml）=6.09比活力U/mg=0.6568粗酶液: 酶活力单位U/ml=1.3总活力U=12.78 蛋白质浓度（mg/ml）=3.542比活力U/mg=0.3670酶液: 酶活力单位U/ml=6.8总活力U=65.96蛋白质浓度（mg/ml）=0.7

5、19 比活力U/mg=9.45764）粗酶液: 纯化倍数=0.56 回收率=0.31酶液: 纯化倍数=14.40回收率=1.60 实验结果讨论：粗酶液的实验结果较为正确，操作较为得当，试剂添加较为合理。但是酶液的纯化倍数较大，而且，回收率好像不太正确，值偏大，可能是添加试剂时的量不太准确，或可能与添加了过多的石英砂有关。或者是离心时有部分液体渗出导致引入误差。下次实验应多加注意，小心用量与操作细节与步骤，争取桌做得更好！