菠萝蛋白酶的提取、初步分离纯化与活性测定

《菠萝蛋白酶的提取、初步分离纯化与活性测定》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、菠萝蛋白酶的提取、初步分离纯化及活性测定14食安（1）班杨泽杰摘要：本文结合考马斯亮蓝G250染色法，研究了不同纯化方法，包括硫酸铵沉淀法、透析法，对菠萝蛋白酶活性的影响。实验结果表明，两种纯化方法都能有效纯化菠萝蛋白酶，但是会对菠萝蛋白酶的活性造成一定的损失。关键词：菠萝蛋白酶沉淀法透析法纯化酶活性前言菠萝蛋白酶（Bromelain，EC3.4.22.3）简称菠萝酶，是从凤梨属植物菠萝中提取的一组复合的半胱氨酸巯基蛋白水解酶，它广泛存在于菠萝的果实、芽、叶、茎。菠萝蛋白酶属于糖蛋白，是由巯基蛋白酶和非蛋白酶组分构成的复杂复合物，因含有一个不稳定的游离巯基，所以菠萝蛋白酶极

2、易被氧化而使其酶活下降。菠萝蛋白酶的相对分子质量大约为33000，等电点9.55，最适pH在7.1左右，在偏酸环境下酶活下降较快，碱性环境能延缓失活。菠萝蛋白酶的温度的最稳定范围是55℃~65℃。金属盐离子中NaCl、KCl对酶活的影响不是很大，维生素C、半胱氨酸、硫代硫酸钠、2-巯基乙醇是菠萝蛋白酶的稳定剂，EDTA能通过螯合对酶活有影响的金属离子而保护菠萝蛋白酶，有机溶剂中甲醇、乙醇、乙二醇对酶活损失较大。在食品工业中菠萝蛋白酶作为一种食品添加剂，能分解蛋白质、肽、酯和酰胺等，可用于肉质嫩化、水解蛋白、啤酒澄清、干酪生产等。在医药上它可以治疗水肿及多种炎症，它能帮助迅速

3、结痂，对正常组织无害，不影响植皮，适用于中小面积深度烧伤的治疗。1实验材料与仪器1.1实验材料与试剂1.1.1实验材料新鲜菠萝（3个），透析袋1.1.2实验试剂（1）盐析粗提液0.1mo1/LpH7.8磷酸缓冲液配制（PBS）（配4000mL），0.01mo1/LpH7.8磷酸缓冲液配制（PBS）（配4000mL）（2）酶活力测定试剂1％酪蛋白（进口分装）（配100mL），激活剂[含20mmo1／L半胱氨酸-盐酸盐、1mmo1/LEDTA-Na2(乙二胺四乙酸二钠)]，10％三氯乙酸(TCA)1.2实验仪器和用品1.2.1实验仪器HJ-6多头磁力搅拌器：常州国华电器有限公司

4、MC-H18S012多功能红外炉：广东美的生活电器制造有限公司DS-1高速组织捣碎机：上海标本模型厂GKC110R2可控硅恒温水浴锅：赏花锦屏仪器仪表有限公司TD5M低速离心机：长沙湘智离心机仪器有限公司TDL-60B台式离心机：上海安亭科学仪器厂722型可见分光光度计：上海舜宇恒平科学仪器有限公司UV5100B型紫外可见分光光度计：上海元析仪器有限公司PL1502-S电子天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司BS110S分析天平北京赛多利斯天平有限公司BCD-539WT冰箱：青岛海尔股份有限公司1.2.2实验用品（1）以组为单位的用品大试管18mm×200mm（10支）

5、、试管架（2个）、烧杯（50mL×1，100mL×2，200mL×1）、滴管（2支）、玻璃棒（2支）、移液管（5mL×1，1mL×2，0.1mL×1，0.2mL×1）、漏斗（3个）、量筒（100mL×1）、研钵、白瓷板、纱布、滤纸、蒸馏水瓶、洗耳球、标签纸、橡皮筋。（2）全班共用的用品试剂瓶（1000mL×7，250mL×3，60mL×20）、烧杯（1000mL×4）、塑料烧杯（2000mL×2）、量筒（500mL×2，1000mL×2）、广泛pH试纸、剪刀、电炉和锅、蒸馏水容器、透析袋（截留相对分子质量8000~14000）。1实验方法1.1菠萝蛋白酶的粗酶提取称取菠萝皮

6、材料30g，将菠萝皮在清水中洗净，沥干，切成小段后置于超高速搅拌机中，加入约60mL预冷的0.1mo1/LpH7.8PBS，持续搅拌10~15min至粉碎，搅拌完成后用4层纱布过滤，得到滤液后，用冷冻离心机于4°C3000rpm离心6min，弃沉淀，即得到菠萝蛋白酶粗提液，测定粗提液的体积、蛋白质含量和酶活性[1]。1.2盐析根据附录的“硫酸铵饱和度计算表”，按30%硫酸铵饱和度计算在上述酶提取液中需添加的固体硫酸铵量，称取固体硫酸铵于研钵中，研磨呈粉末，慢慢小量分次向酶提取液中添加固体硫酸铵，边加边搅拌，使溶液最终硫酸铵饱和度为30%，放置于冰水混合物（4℃）30min后

7、，酶蛋白沉淀析出，4°C4000rpm离心10min，收集沉淀，加入0.1mo1/LpH7.8PBS约15mL至完全溶解，测定其体积、蛋白质含量和酶活性[2]。1.3透析将溶解液装入2.5cm×8cm透析袋（预先将透析袋在蒸馏水中煮沸30min）中，于500mL烧杯中，在磁力搅拌器搅拌下用蒸馏水透析，15min换水一次，换水3～4次后，检查SO42-是否已被除净（检查的方法是：取2mLBaCl2溶液放入一支试管，滴加2～3滴透析外液至试管中，若出现白色沉淀，表示SO42-未除净，若无沉淀出现，表示透析完全）。若透析