肝癌细胞的研究进展

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1、乙肝细胞的研究进展引言：据有关资料显示，全世界约有3亿乙型肝炎病毒感染者。中国占1亿人.且每年新增患者3()0()刀以上。据1992年全国病毒性肝炎流行性调杏，屮国有6亿人曾感染过乙型肝炎病毒，其中1.2亿是乙肝表面抗原携带者。据统计，肝癌患者中乙型肝炎相关者约占70〜80%。一般认为部分乙肝患者转变为肝癌的进程为：乙型肝炎一-慢性肝炎一-肝硬化一肝癌【】】。故了解乙肝的发病机理及防治方法，掌握肝癌细胞cDNA文库的构建及鉴定方法显得尤为重要。关键词:肝癌细胞；发病机理；防治方法；cDNA文库1、乙肝的发病机理及病因1.1乙肝的发病机理这是一•个复杂的问题，迄

2、今尚未完全阐明。国内外学者对此进行了大量研究。结果表明，乙型肝炎病人的肝脏受损并不是乙型肝炎病薄在肝细胞内繁殖的直接结果.而是机体的免疫反应造成的。乙型肝炎病毒感染人体麻，可激发机体产生对乙型肝炎病毒的各种细胞免疫反应和体液免疫反应，并激发自身免疫反应引起免疫调节功能紊乱。机体的这些免疫反应，可清除己感染病毒的肝细胞•又对引起肝细胞的损伤，造成不同类烈的病理变化及临床转归。幼儿时的感染，常常因免疫功能不健全而缺乏上述的免疫反应，造成乙型肝炎病毒携带状态或慢性肝炎。1.2乙肝的病因病毒感染：乙肝病毒具有传染性强，传播途径复杂，流行面广泛,发病率高等特点;酗酒：酒

3、精及具代谢产物对肝细胞的损害能引起肝炎。据研究，如果每犬摄人酒精1509以上，持续5年以上.90%的人可发生各种肝损害：1()年以上则有约34%发生慢性肝炎.约25%发展为川谀化：药物或化学毒物：许多药物和化学壽物都可引起川•损害。如四氯化碳、四环素、伸汞等，造成药物性肝炎或中毒性肝炎。肝损程度取决丁•药物的剂量、时间。以及个体差异。长期服用或反复接触，可致慢性肝炎，甚至肝破化【2】。2、乙肝细胞cDNA文库的构建及鉴定2.1材料人肝癌细胞株HHCC,E.c01iY1090hsdR株，gtll噬菌体去磷酸化的左、右臂DNA。质粒BluescriptSK及感受态

4、细菌TGI,TR1ZOL试剂,OligoteXmRNAkit,UniversalRiboclonecDNASynthesiskit,EXpandTMReVerseTranscriptase,LambdaPackagingkit,[O-32P]dCTP.o2、2方法1、培养HHCC至旺盛生长期，倾去培养液后加入TRIZOL试剂，裂解细胞并抽提出总RNA;用OligoteXmRNAkit试剂从总RNA中纯化出含polyA的mRNA并用紫外分光光度计(PerkinElmer公司产品D测定其纯度及含量。2、以6g的mRNA为模板，3ugOligo(dTD15为引物，E

5、xpandTMReVerseTranscriptase为反转录酶，42C60min合成cDNA第1链；然后向其中加入10＞第2链缓冲液再加入DNA聚合齣I及RNase-22C保温60niin合成cDNA第2链;双链cDNA(dscDNAD合成后加入T4DNA多聚酶37C保温10min削平双链cDNA的两端以便于后续的连加人工接头反应.在cDNA第12链的合成过程屮均取出一小份反应体系加入［O-32P］dCTP以示踪cDNA合成的效果.用T4DNA连接酶将EOORI人工接头与肖U平后的dscDNA连接用Sephacryl-S400柱去除小于500bp的cDNA片

6、段及游离的EOORI人工接头.3、用T4多核廿酸激酶对连接上cDNA的人工接头磷酸化然后再与去磷酸化的7gtll噬菌体左〜右臂相连连接体加入到噬菌体体外包装系统中22C保温3h包装成噬菌体.混合多份包装产物建成重组7gtll噬菌体文库.4、取出1pL的包装噬菌体按1=1000和1=10000倍稀释后感染对数生长期的E.00zY1090铺平板并在上层培养基中加入终浓度为5g/L的IPTG和11g/L的X-Gal37C培养过夜，次LI数噬斑数目及蓝〜白噬斑之比计算出文库的人小；为了验证插入的cDNA片段的平均大小我们将与构建文库用的同一-批cDNA加上EOORT人

7、工接头后与经内切臨EOORI猶切并去磷酸化的质粒载体BluescriptSK相连并转化感受态细菌TG1同样铺平板加入IPTG和X-Gal37C培养过夜，次LI挑出9个白色细菌斑分别接种入5mL液体LB培养基中培养，小量捉取质粒并用内切酶EOOR1酶切后进行琼脂糖凝胶电泳以鉴定切出片段的大小【3】。2、3结果1、总RNA及mRNA的提取及纯化总RNA提収出來之后经变性凝胶电泳［3］.结果表明总RNA主要是28S和18SrRNA且28S带的亮度是18S带亮度的2倍以上，说明总RNA捉取完好，未被降解(Fig1),总RNA经过OligoteX纯化柱纯化后获得mRNA

8、,经测定约占总RNA量的1.84%且A