Kisspeptin-10对奶牛乳腺上皮细胞中CSN2合成的影响及机制

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1、分类号：Ｓ８５２．２１单位代８３码：１０１研究生学号：２０１５８５２００７密级：公开吉林大学硕士学位论文学术学位（）Ｋｉｓｓｐｅｐｔｉ－１０对奶牛乳腺上皮细胞中ＣＳＮ２合成的影响及机制Ｅ－ｆｆｅｃｔａｎｄｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆＫｉｓｓｐｅｐｔｉｎ１０ｏｎｔｈｅＣＳＮ２ｓｎｔｈｅｓｉｓｏｆｂｏｖｉｎｅｍａｍｍａｒｅｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓｙｙｐ作者姓名：孙建华专业：基础兽医学６研究方向：动物生理学指导教师：柳巨雄教授培养单位：动物医学学院２０１８年

2、６月未经本论文作者的书面授权，依法收存和保管本论文书面版本、电子版本的任何单位和个人，均不得对本论文的全部或部分内容进行任何形式的复制、修改、发行、出租、改编等有碍作者著作权的商业性使用（但纯学术性使用不在此。否则限），应承担侵权的法律责任。吉林大学硕士学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交学位论文，是本人在指导教师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的作品成果。对本文的研宄做出重要贡献的个人和集体，均己在文中以

3、明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。ｓ学位论文作者签名：曰期：加汾年／月幺日Kisspeptin-10对奶牛乳腺上皮细胞中CSN2合成的影响及机制EffectandmechanismofKisspeptin-10ontheCSN2synthesisofbovinemammaryepithelialcells作者姓名：孙建华专业名称：基础兽医学指导教师：柳巨雄教授学位类别：农学硕士答辩日期：2018年06月03日本研究资助项目国家自然科学基金项目资助NationalNaturalScience

4、FoundationofChina(No.31672509,31372396,31602020)中文摘要Kisspeptin-10对奶牛乳腺上皮细胞中CSN2合成的影响及机制乳蛋白是构成牛奶营养品质的主要物质基础，牛奶中乳蛋白含量是奶业核心竞争力的重要标志。蛋白质和多肽类激素对奶牛乳蛋白合成具有重要的调控作用。Kps（Kisspeptins）是具有多种生物功能的多肽类激素，由抑癌基因KISS-1编码，其合成后在体内迅速裂解为Kp-10（Kisspeptin-10）等小肽，这些短肽通过特异性的与G蛋白偶联受体54（guanosin

5、e-bindingProteinCoupledReceptor54,GPR-54）结合而发挥作用。Kps在体内主要参与调节垂体激素分泌、季节性繁殖和能量平衡以及参与青春期启动等重要生命活动，是当前神经内分泌生理学研究的热点之一。已有研究表明Kps在一些细胞中能活化ERK1/2和mTOR等在乳蛋白合成过程中的关键信号通路，但是关于其对奶牛乳腺上皮细胞（bovinemammaryepithelialcells,bMECs）中乳蛋白合成的影响，目前尚未有报道。因此，本实验通过分析高乳品质和低乳品质奶牛乳腺组织中Kps受体GPR54水平

6、与β-酪蛋白（β-casein,CSN2）含量的关系，首先明确Kps受体GPR54和CSN2含量的相关性；然后分离培养bMECs，添加Kp-10和/或信号阻断剂后，研究Kp-10对bMECs中CSN2的影响及其机制。首先，通过检测高乳品质和低高乳品质奶牛乳腺组织中CSN2和GPR54基因和蛋白水平，推测Kps和乳蛋白合成的相关性，结果显示高乳品质奶牛乳腺组织中CSN2以及GPR54基因和蛋白表达均显著高于低乳品质组，相关性分析表明GPR54水平和CSN2含量呈显著正相关，由此可推测Kps可能通过其受体GPR54促进CSN2合成。

7、然后，通过组织块儿培养法分离培养了处于泌乳期荷斯坦奶牛的bMECs，并利用CK-18抗体进行免疫荧光鉴定细胞类型、利用流式细胞术检验分离细胞的纯度，并利用荧光定量PCR和Westernblot检测1-4代bMECs中CSN2和GPR54的表达情况。结果发现分离培养的细胞为bMECs并且细胞纯度高达95.11%；在1-4代bMECs中能稳定表达CSN2和GPR54。这些结果说明分离培养的bMECsI纯度达到实验要求，并且细胞能稳定表达GPR54，为Kps促进CSN2的合成提供了依据。进一步，我们选用Kp-10这一小肽激素开展了后续

8、的实验。在bMECs中研究发现添加不同浓度Kp-10（0-100nM）后，100nM的Kp-10能促进CSN2的基因和蛋白水平增加，GPR54的特异性阻断剂Peptide-234能抑制这种效应，说明在bMECs中Kp-10通过激活GPR54促进CSN2的合成；进