亮氨酸对奶牛乳腺上皮细胞酪蛋白合成影响和机理研究

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1、亮氨酸对奶牛乳腺上皮细胞酪蛋白合成影响和机理研究EffectsofLeucineoncaseinsynthesisanditsregulatingmechanisminbovinemammaryepithelialcell作者姓名：代文婷专业名称：动物营养与饲料科学指导教师：王加启研究员学位类别：农学硕士答辩日期：2015年6月3日本研究由：1.国家重点基础研究发展计划（项目编号：2011CB100805）；2.农业产业技术体系专项资金（项目编号：nycytx-04-01）；3.中国农业科学院科技创新工程（项目编号：ASTIP-IAS12）。中文摘要亮氨酸

2、对奶牛乳腺上皮细胞酪蛋白合成影响和机理研究本试验主要以体外培养的奶牛乳腺上皮细胞为模型，研究亮氨酸浓度对乳腺上皮细胞中酪蛋白合成的影响和机理研究，旨在揭示不同浓度的亮氨酸在转录和翻译水平上调控酪蛋白合成的分子机理，以提高乳蛋白的含量，从而为改善乳品质提供一定的理论依据；此外该研究还以永生化的奶牛乳腺上皮细胞为模型，建立了酪蛋白合成的非细胞体系（cell-freemodel），以模拟亮氨酸调控乳蛋白合成的信号通路，从而为体外氨基酸对乳蛋白合成的研究提供一种新的研究方法。本试验包括以下三部分：1.以体外培养的奶牛乳腺上皮细胞为模型，采用噻唑蓝（MTT）法研究不

3、同浓度的亮氨酸添加水平和培养时间对乳腺上皮细胞增殖的影响，得出亮氨酸作用的最佳条件（包括作用浓度和作用时间），为后续试验提供参考，同时也为阐明亮氨酸能促进乳腺上皮细胞增殖的机制提供一些依据。试验采用完全随机设计，以0.00mM/L亮氨酸处理为对照组（0组），试验组培养基分别添加0.1125mM/L（0.25组），0.225mM/L（0.5组），0.45mM/L（1组），0.9mM/L（2组），1.8mM/L（4组），3.6mM/L（8组），7.2mM/L（16组），14.4mM/L（32组）的亮氨酸；培养时间分别为24h、48h和72h。

4、试验重复3次。结果表明：亮氨酸在0.45~3.6mM/L（1组~8组）时对奶牛乳腺上皮细胞的增殖作用明显，且在48h培养时间时其促增殖作用最强（P0.01）。2.以体外培养的奶牛乳腺上皮细胞为模型，研究不同浓度的亮氨酸对乳腺上皮细胞中酪蛋白合成相关基因的影响。试验以0.00mM/L亮氨酸处理为对照组（0组），试验组培养基分别添加0.1125mM/L（0.25组），0.225mM/L（0.5组），0.45mM/L（1组），0.9mM/L（2组），1.8mM/L（4组），3.6mM/L（8组），7.2mM/L（16组），14.4mM/L（

5、32组）的亮氨酸。先对细胞进行4h的饥饿处理，然后添加不同水平的亮氨酸处理48h，每个处理3个重复，试验也重复3次。采用荧光定量反转录PCR（RT-PCR）技术检测不同浓度亮氨酸处理条件下酪蛋白及其合成相关基因的表达量，找出最佳的亮氨酸作用浓度。结果表明：I1）亮氨酸促进酪蛋白基因表达的最佳浓度为0.9mM/L。此水平下，αs1-酪蛋白(αs1-casein，CSN1S1)、αs2-酪蛋白(αs2-casein，CSN1S2)、β-酪蛋白（β-casein，CSN2）和κ-酪蛋白（κ-casein,CSN3）的基因表达量均显著上调，且与对照组相比差异显著

6、（P<0.05）。2）亮氨酸促进酪蛋白合成转录和翻译基因表达的最佳浓度也为0.9mM/L。此水平下，与酪蛋白转录相关JAK2-STAT5信号通路的基因，信号转换和转录激活因子5（Signaltransducersandactivatorsoftranscription5，STAT5）和酪氨酸激酶2（JanusKinases2，JAK2）的表达均上调，与对照组相比差异均显著（P<0.05）。与酪蛋白翻译相关的mTOR信号通路中哺乳动物雷帕霉素靶蛋白基因（mammaliantargetofrapamycin，mTOR）和p70核糖体蛋白S6激酶1（riboso

7、malproteinS6kinase-1，S6K1）基因的表达均上调，而且与对照组相比，二者的基因表达量差异均显著（P<0.05），但真核翻译起始因子4E结合蛋白1（Eukaryotictranslationinitiationfactor4Ebindingprotein1，4E-BP1）表达下调，与对照组相比差异也显著（P<0.05）。3.以永生化的奶牛乳腺上皮细胞（CMEC-H）为基础，构建了体外模拟氨基酸调控乳蛋白合成的非细胞体系（cell-freemodel）。此非细胞体系构建之前，探究了穿针法（Gauge26，G26）温和裂解CMEC-H的方法。

8、该非细胞体系主要由粗提溶酶体组分（Crudelysosomes，C