gh和igf-i对奶牛乳腺上皮细胞中酪蛋白合成的调节作用机制

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1、课题来源本研究由国家重点基础研究发展计划(973计划)项目“牛奶重要营养品质形成与调控机理研究”(2011CBl00800)子课题“激素和功能性氨基酸对乳腺中酪蛋白合成的调节作用”(2011CBl00803)资助。ThisresearchwassupportedbytheNationalKeyBasicResearchProgram(973Program)(20l1CB100803)．GH和IGF—I对奶牛乳腺上皮细胞中酪蛋白合成的调节作用机制㈣州大学嚣淼，225009)I燃嘲一(扬州大学动物科学与技术学院，』，二二I：—■’一摘要本研究以奶牛乳腺

2、上皮细胞为材料，采用乳腺上皮细胞体外分离培养技术、细胞分子生物学相关技术，研究了生长激素(GH)和胰岛素样生长因子．I(IGF．I)对乳酪蛋白合成、乳蛋白合成调节关键激酶和调节因子基因表达以及细胞增殖与凋亡的影响。试验一、体外分离培养了奶牛乳腺上皮细胞并鉴定其是否表达生长激素受体(GHR)和胰岛素样生长因子．I受体(IGF．IR)。从泌乳荷斯坦奶牛活体采集乳腺组织，利用胶原酶消化分离培养奶牛乳腺上皮细胞，通过形态学、特异性蛋白(角蛋白．18)表达、特异性基因(CSNlSl、CSNlS2、CSN2、CSN3)表达鉴定纯化后的奶牛乳腺上皮细胞。免疫荧光

3、化学法鉴定角蛋白．18的表达，RT-PCR法鉴定四种酪蛋白基因CSNISl、CSNlS2、CSN2、CSN3以及两种受体基因GHR、IGF．IR的表达。结果发现，分离纯化后的乳腺上皮细胞呈典型的铺路鹅卵石样，能够特异性表达角蛋白．18和四种酪蛋白基因，同时检测到了GHR和IGF—IR的表达，细胞冻存再复苏后有较高的成活率。结果表明，本研究成功分离并获取了高纯度的奶牛乳腺上皮细胞且冻存后能够用于后续的试验，GH可能通过直接或间接通过IGF—I作用于奶牛乳腺上皮细胞上相应的受体来发挥作用。试验二、测定了GH和IGF．I对奶牛乳腺上皮细胞佟酪蛋白基因表达

4、与蛋白合成的影响。对照组为无血清生长培养基，处理组在对照组的基础上添加GH(100ng／mL)、IGF．I(100ng／mL)或GH(100ng／mL)+IGF—I(100ng／mL)，细胞培养24h后，采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法测定K．酪蛋白基因(CSN3)的相对表达量，ELISA法测定K_酪蛋白合成量。结果发现，GH和IGF．I单独或联合添加到无血清生长培养基中均能显著提高CSN3基因表达量(尸0．05)，此外，无论是在基因表达水平还是蛋白水平都没

5、有观察到GH和基因表达的影响。试验处理方式同试验二，采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法测定Janus激酶2(JAK2)、信号转导子与转录激活子5(STAT5)、E74一样转录因子5(ELF5)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、核糖体蛋白S6激酶1(rpS6K1)、真核生物起始因子4E结合蛋白1(4EBPl)、真核生物起始因子4E(elF4E)、真核生物延伸因子2(eEF2)基因的相对表达量，进一步利用Westernblot法在蛋白水平测定了mTOR的表达量。结果发现，与对照组相比，单独添加GH有提高ELF5基因mRNA表达量的趋势(P<

6、0．1)，而单独添加IGF—I显著促进了rpS6K1mRNA以及roTOR的表达量(P<0．05)，但GH没有进一步加强IGF—I的这种作用。结果表明，GH和IGF．I可能单独通过影响调控乳蛋白合成的关键激酶及调节因子的基因表达来调节K．酪蛋白的合成。试验四、测定了GH和IGF．I对奶牛乳腺上皮细胞增殖和凋亡的影响。细胞处理方式同试验二，采用CCK．8法测定4～96h内奶牛乳腺上皮细胞的增殖情况，用FITC．Annexinv／PI双染法检测24h内细胞凋亡率，同时用RT-qPCR法测定了IGFBP．5基因的相对表达量。结果发现，补充GH没有促进乳腺

7、细胞的增殖(尸>0．05)，而补充IGF-I在4“h有显著促进增殖的效果(P0．05)。补充GH和IGF．I显著减少了凋亡晚期的细胞数(P

8、，进而促进泌乳。关键词：生长激素；胰岛素样生长因子．I：奶牛乳腺上皮细胞；酪蛋白；基因表达MechanismandRegu