泌乳相关激素对乳酪蛋白在奶牛乳腺上皮细胞合成的影响及其调控机制.pdf

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1、万方数据课题来源本论文研究受国家重点基础研究发展计划(973计划)：激素和功能性氨基酸对乳中酪蛋白合成的调节作用(211CBl00803)的资助，本论文属于该课题的部分研究。ThisdissertationwasapartofthefundedresearchprojectwhichsponsoredbyNationalKeyFundamentalResearchandDevelopPlan(973)(21CB100803)．万方数据【玎青：泌乳相关激素对乳酪蛋白在奶q：-乎L腺上皮细胞合成的影响及其调控机制中文摘要牛奶质量安全已成为制约我国奶业健康发展的首要

2、问题。乳蛋白是构成牛奶营养品质的主要物质基础，它既涉及乳品质量安全，又是奶业核心竞争力的标志。目前我国牛奶中乳蛋白的含量普遍偏低(平均为2．8％)，不仅达不到奶牛的遗传潜力，甚至低于国家标准(2．9596)。因此，立足我国现实的饲料资源，阐明内源泌乳激素对乳蛋白合成与调控的机理，建立通过内源激素调控改善牛奶品质的理论和方法，已经成为奶业持续健康发展的重要需求。本研究以胰岛素、催乳素和氢化可的松为研究对象，以酶消化法培养得到的奶牛乳腺上皮细胞系为载体分别研究了胰岛素、催乳素和氢化可的松对奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白合成的影响。试验一、选择在扬州大学农牧场饲养的健康泌乳

3、期荷斯坦奶牛，活体无菌采取乳腺组织，以酶消化法分离、培养、纯化奶牛乳腺上皮细胞，研究奶牛乳腺上皮细胞的体外培养效果。结果表明：以DMEM／F12为基础培养液，在培养液中添2N10％的胎牛血清、300IU／mL的双抗、25ug／mL两性霉素B、表皮生长因子、ITS、氢化可的松、催乳素等组成的完全培养液中奶牛乳腺上皮细胞生长良好。上皮细胞显微结构显示8代以内，大多数奶牛乳腺上皮细胞在体外培养过程中呈卵圆形和多角形，细胞之间连接成片，且细胞界限明显。荧光免疫细胞染色分析结果表明分离培养的乳腺上皮细胞几乎全部呈阳性，四种酪蛋白基因PCR电泳产物结果清晰可见，这证实酶消

4、化法得到的细胞是乳腺上皮来源，且具有正常生理功能，证明本试验成功建立了奶牛乳腺上皮细胞系。试验二、以前期建立的奶牛乳腺上皮细胞系为基础，分别采用单因素5水平试验设计研究了在培养液中添加不同浓度的催乳素(0、5、50、500、5000ng／mL)、胰岛素(0、5、50、500、5000ng／mL)和氢化可的松(0、1、10、100、1000ng／mL)对奶牛乳腺上皮细胞生长、细胞信号通路相关基因表达、乳蛋白合成相关激素受体基因表达和酪蛋白相对含量的影响。结果表明：①催乳素能显著促进奶牛乳腺上皮细胞的增殖、促进s-PRLR基因表达、促进K一酪蛋白和总酪蛋白的分泌(

5、P

6、，氢化可的松对奶牛乳腺上皮细胞的增殖无影响，24h之后1000ng／mL的氢化可的松显著抑制了奶牛乳腺上皮细胞的增殖；卜100ng／mL的氢化可的松显著增加了奶牛乳腺上皮细胞CSN3基因表达，1ng／mL显著增加了NR3C1基因表达，卜10ng／mL的氢化可的松显著增加了奶牛乳腺上皮细胞中K一酪蛋白和总酪蛋白的相对含量。试验三、以试验二(单因素试验)所得到的胰岛素、催乳素和氢化可的松的最佳作用剂量为基础，以前期冻存的奶牛乳腺上皮细胞为媒介，采用L。(34)正交试验设计，研究了三种激素协同作用对奶牛乳腺上皮细胞增殖和凋亡的影响，对泌乳激素受体基因表达的影响，对乳

7、蛋白合成影响重大的两条信号通路中相关基因表达的影响及对K一酪蛋白和总酪蛋白相对含量的影响，结果表明：①三种激素协同作用能显著促进奶牛乳腺上皮细胞的增殖；②5ng／mL催乳素、50ng／mL胰岛素和lng／mL氢化可的松能显著增加mTOR、Rheb、PKB、PRAS40、STAT5a和P53基因的表达，三种激素对mTOR信号通路各基因表达的影响程度不一致，对JAK—STAT信号通路各基因表达影响的优先次序为胰岛素>氢化可的松>催乳素，即胰岛素对JAK—STAT信号通路各基因表达的影响最大，其次是氢化可的松，最后是催乳素；③三种激素对s—PRLR基因表达影响的最优

8、组合为催乳素5ng／mL、胰岛素50n