hmba诱导mel细胞红系分化的蛋白质组学和eif4h在红系分化中的功能研究[硕士论文]2013年

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1、浙江理工大学硕士学位论删蚍诱导MEL细胞红系分化的差异蛋白质组学和eIF4H在红系分化中的功能研究摘要血细胞的生成是一个复杂的多程序过程，早期多潜能祖细胞和造血干细胞(HSCs)产生定向的红系祖细胞，红系祖细胞在一系列因子的调控下沿着红系分化程序向成熟红细胞分化，经排核后成为红细胞。早期造血祖细胞分化异常时将导致白血病细胞的产生。鼠红白血病MEL细胞是Friend等人从Friend病毒感染的鼠脾脏组织中分离得到一种永生细胞系。MEL细胞在特定化学诱导剂如六甲基烯二乙酰胺(HMBA)或丁酸钠的诱导下可定向的朝红系细胞终末分化并产生大量的血红蛋白。终末分化的MEL细

2、胞表现出和造血祖细胞正常发育过程相似的一些特征，包括表达红系谱系特异性标志、增殖能力的丧失和核固缩等。因此MEL细胞在了解红系分化的分子机制方面为我们提供一个非常合适的模型。本论文以化学诱导剂HMBA诱导鼠红白血病MEL细胞分化为模型，利用台盼蓝排除法、MTT实验、联苯胺染色、红系细胞表面特异性标志Terl9免疫荧光检测和RT-PCR检测珠蛋白基因等方法对HMBA诱导1．5d的MEL细胞生长、分化情况进行分析。同时对HMBA诱导不同时间点的MEL细胞的蛋白，通过双向凝胶电泳结合质谱技术(2DE．MS)，对差异蛋白表达谱进行分析。结果表明：HMBA抑制了MEL细胞

3、增殖。对HMBA处理3．5d的MEL细胞进行联苯胺染色分析，发现HMBA诱导MEL细胞红系分化呈时间依赖性而非剂量依赖性关系。对HMBA处理2．5d的MEL细胞的免疫荧光检测发现红系细胞表面特异性标志Terl19在2d就开始表达。对HMBA处理2d和3d的MEL细胞珠蛋白基因的RT-PCR检测发现HMBA只诱导成体血红蛋白表达。对HMBA处理6h、12h、24h、36h、48h、72h、96h和120h的MEL细胞的蛋白表达谱进行分析，通过双向凝胶电泳偶联质谱技术(2DE．MS)，结合生物信息学手段鉴定出了67个差异表达的蛋白质。这些蛋白质参与了多个生物学过程，

4、如蛋白质合成、信号转导、酶促反应和细胞骨架等。根据染色体定位分类，其中大部分蛋白定位在14号染色体、1l号染色体、4号染色体、2号染色体和15号染色体。对真核生物翻译起始因子4H(eukaryotictranslationinitiationfactor4H，elF4H)、14．3．3p旭和prohibitin进行分析验证。Westernblot分析发现这三个蛋白在HMBA诱导MEL细胞红系分化过程中的表达变化与2DE．MS结果一致，表明本实验2DE．MS结果可靠。eIF4H是一个非常重要的真核生物翻译起始因子，通过选择性剪接产生27kDa和25kDa浙江理工大

5、学硕士学位论HMBA诱导MEL细胞红系分化的差异蛋白质组学和eIF4H在红系分化中的功能研究两个蛋白亚型。本课题组在前期丁酸钠诱导MEL细胞红系分化的蛋白质组学研究中，发现elF4H蛋白在红系分化过程中下调表达。而在本实验中用HMBA诱导MEL细胞红系分化筛选差异表达蛋白时同样发现该蛋白在HMBA诱导MEL红系分化过程中表达下调。HMBA和丁酸钠诱导MEL细胞红系分化机制完全不同，但两者均可诱导elF4H下调表达，提示该蛋白在红系分化过程中起重要的调控作用，本文构建elF4H低表达的MEL细胞稳定株，拟对elF4H在红系分化过程中的功能进行初步研究。经过West

6、ernblot分析发现elF4H在丁酸钠诱导MEL红系分化过程中表达下调，但RT-PCR分析发现在基因水平表达没有变化。免疫荧光分析发现elF4H定位在MEL细胞的细胞核和细胞质，但在丁酸钠诱导MEL细胞红系分化过程中elF4H由细胞核向细胞质迁移。利用pLKO．1．shRNA质粒转染293T细胞获得可使elF4H蛋白低表达的慢病毒，通过慢病毒侵染MEL细胞并经嘌呤霉素筛选得到了elF4H低表达的MEL细胞稳定株。MTT比色法分析发现shRNA介导的eIF4H低表达抑制了MEL细胞的增殖。联苯胺染色分析发现：虽然elF4H低表达不能诱导MEL细胞向红系分化，但可

7、促进丁酸钠诱导MEL细胞红系分化的进程。为了探究elF4H在红系分化中的作用机制，运用Westernblot分析发现elF4H低表达在蛋白质翻译水平抑制了PU．1和c．myc的表达，从而促进了红系分化／抗增殖。此外已经构建了N．TAP．elF4H表达载体并转染293T细胞，获得了N．TAP．elF4H融合蛋白，为后续进行串联亲和层析，分离纯化与elF4H相结合蛋白并对其功能进行研究。以揭示elF4H如何调控细胞增殖和分化的分子机制。关键词：elF4H；MEL细胞；HMBA；红系分化：RNA干扰浙江理工大学硕士学位论ttklBA诱导MEL细胞红系分化的差异蛋白质组

8、学和eIF4H在红系分化