t-2毒素影响k562细胞向红系细胞分化相关的基因组和蛋白组研究

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1、华中农业大学硕士学位论文T--2毒素影响K562细胞向红系细胞分化相关的基因组和蛋白组研究姓名：李婷婷申请学位级别：硕士专业：基础兽医学指导教师：袁宗辉201206"I"-2毒素影响K562细胞向红系细胞分化的基因组和蛋白质组研究T-2毒素影响K562细胞向红系细胞分化相关的基因组和蛋白组研究专业：兽医药理学与毒理学2012届硕士研究生：李婷婷指导老师：袁宗辉教授(国家兽药残留基准实验室(HZAU)／农业部食品安全评价重点开放实验室，华中农业大学中国武汉430070)摘要T-2毒素是由镰刀菌等霉菌产生的单端孢霉烯族A类毒素。T-2毒素广泛存在于自然界，是一类常见的引起

2、全球性谷物粮食污染性霉菌毒素之一。该毒素是单端孢霉烯族毒素中急性毒性最强的一种，严重危害人畜健康。动物食入这种霉变的粮食则会引起拒食、呕吐、白细胞减少、造血系统萎缩及各种免疫抑制反应，抑制蛋白质合成，从而引起致癌性等毒性反应。动物实验研究发现，T．2毒素的主要靶器官之一是动物的造血系统，可引起动物骨髓和脾脏等造血器官损伤，使动物造血系统中多能造血干细胞(CFUs)，粒系祖细胞(CFU．GM)，分化后红系祖细胞(CFu．E)，分化前红系祖细胞(BFU．E)等明显减少，红细胞和血小板计数下降，贫血等。然而，早期对单端孢霉烯族毒素对造血系统损伤的研究并不深入，T-2毒素影响

3、造血干细胞分化的分子机制及信号通路研究还不清楚。鉴于T-2毒素造血系统毒性的重要性，我们选择处于多能造血干细胞状态的人红白血病K562细胞为研究对象，利用目前比较先进的基因芯片技术和双向凝胶电泳技术，通过分析T-2毒素对造血干细胞分化毒性相关的差异基因组和差异蛋白质组，探讨T-2毒素影响造血干细胞分化为红系细胞的分子机理，深入揭示T-2毒素血液系统毒性的机制，为其解毒提供理论依据。本研究采用MTT法检测T-2毒素(5～50nM)对K562细胞株分别作用24～72h后细胞活力的影响，并检测T-2毒素(5～50nM)对K562细胞作用48h后细胞LDH释放率，发现T-2毒

4、素能够显著抑制K562细胞活力，表现出显著的时间、剂量依赖性的毒性效应。通过流式细胞术检测特异性结合CD235a．FITC抗体的红系分化K562细胞数目，确定T-2毒素对K562细胞红系分化的细胞毒性。发现阴性对照丁酸钠处理K562细胞后，随孵育时间延长，细胞向红系分化的数目显著增加，且48h诱导细胞红系分化最华中农业大学2012届硕士研究生学位论文显著，为空白对照组的5．36±0．59倍。低浓度T-2毒素(5nM)处理细胞后，同样可以促进K562细胞向红系细胞分化；高浓度T-2毒素(50nM)处理细胞后，则表现为显著抑制K562细胞的红系分化，48h抑制作用最显著，

5、为0．23±O．03倍。在5～50nMT-2毒素处理细胞48h后，在T-2毒素浓度为15nM时出现显著抑制K562细胞分化作用。因此，在后续实验中选择48h作为药物作用的最佳时间，15nM为毒素作用剂量。将荧光探针DCFH．DA加入与15nMT-2毒素共孵育2h、4h、8h、12h后的K562细胞中，用流式细胞仪检测标记荧光探针的细胞，确定T-2毒素作用下细胞内ROS的释放量。结果显示，T-2毒素可以引起K562细胞内ROS释放呈现时间依赖性变化。T-2毒素在作用细胞4h时ROS释放量最高，达到2．25±O．10倍，随着T-2作用时间延长，ROS释放量逐渐降低，恢复到

6、正常水平。用15nMT-2毒素，O．6mM丁酸钠和lmM过氧化氢分别与K562细胞孵育48h，用基因表达谱芯片检测三种药物对K562细胞mRNA表达量改变。结果显示，与空白对照组相比，T-2毒素组有1670个差异基因，其中上调的有653个(已知名称和功能的基因有583个)，下调的有1017个(已知基因有398个)；丁酸钠处理组有317个差异基因(已知基因占170个)，过氧化氢处理组有282个差异基因(己知基因占116个)。T-2毒素组与丁酸钠组相比较有67个共同作用上调基因，56个共同的下调基因；T-2毒素组与过氧化氢组相比较有25个共同上调基因，167个共同的下调基

7、因。将这些差异基因按生物学进程共分为9类：核酸转录调控、物质代谢、能量代谢、细胞进程、造血相关、细胞转运、细胞形态、细胞内信号转导、细胞应激反应。分析相关基因功能，我们推断转铁蛋白(TF)及血红素合成可能是T-2毒素的抑制造血细胞分化毒性的重要分子靶点；大量与细胞周期相关基因出现差异性表达，如cyclinB2、cyclinG1、cyclinG2、CDK2、ATM、cyclinD1等。另外，在流式细胞术测定毒素对K562细胞周期影响，结果显示高浓度T-2毒素(15nM)可以引起细胞阻滞在S期，细胞周期阻滞使细胞增殖停止，造血祖细胞数目减少也会影响其分化