黑龙江野鲤细菌人工染色体基因组文库构建

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1、第16卷第2期中国水产科学Vol.16No.22009年3月JournalofFisherySciencesofChinaMarch2009黑龙江野鲤细菌人工染色体基因组文库构建121耿波，关云涛，孙效文（1.中国水产科学研究院黑龙江水产研究所农业部北方鱼类生物工程育种重点实验室，黑龙江哈尔滨150070；2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室，黑龙江哈尔滨150001；）摘要：为了开展鲤基因组研究，深入研究遗传连锁图谱遗传标记的定位及数量性状的定位和克隆，并最终为分子育种提供服务，本实验构建了鲤的BAC基因组文库。通过采集黑龙江野鲤（Cyprinuscaxp

2、iohaematopterus）全血细胞制备琼脂糖凝胶包埋块的方法获得了高分子量（HMW）DNA。通过BamHⅠ部分酶切和PFGE电泳分离选择获得100～300kb的DNA片段，用电洗脱和透析的方法对产物进行浓缩和纯化。纯化的HMWDNA连接到大小为7.2kb的克隆载体pEZBAC上。为了评估构建的文库的质量使用一系列引物对文库进行了验证。本研究首次构建黑龙江野鲤的BAC文库，该库含有46656个克隆，插入片段大小在50～300kb之间，平均大小在100kb左右，覆盖鲤全基因组2.45倍，调取任一基因的概率为90%左右。获得的BAC克隆，保存在378块96孔板和27块384孔板中。

3、建立了高效稳定的2步3维PCR筛选黑龙江野鲤BAC文库的方法。本实验为今后进一步进行鲤的功能基因定位及染色体步行、BAC-FISH等研究工作打下重要基础。[中国水产科学，2009，16（2）：165-172]关键词：黑龙江野鲤；细菌人工染色体（BAC）；基因组文库；超级池中图分类号：S965.116　　　　　　文献标识码：A　　　　　　文章编号：1005-8737-（2009）02-0165-08细菌人工染色体BAC的复制子来源于单拷贝质的最大问题就是遗传背景不清楚，严重地影响了鲤粒F因子，故BAC在宿主菌内只有极少数拷贝数，可稳良种的保存和鉴定工作的进行。因此，开展鲤基因[1-2

4、]定遗传，无缺失、重组和嵌合现象。BAC以大肠杆组研究计划势在必行。本研究目的在于构建高覆盖菌为宿主，转化效率较高，常规方法（碱裂解）即可分率的鲤的BAC基因组文库，为今后开展鲤基因组、功离BAC，蓝白斑、抗生素、菌落原位杂交等均可用于目能基因组及蛋白质组研究做准备，并为进一步深入的基因筛选，而且可对克隆在BAC的DNA直接测序。研究遗传连锁图谱遗传标记的定位和数量性状的定因此，BAC基因组文库的构建对模式生物的基因组研位和克隆等工作打下基础。究，如人类、斑马鱼（Daniorerio）、小鼠等作出巨大的贡1　材料与方法献，并在基因组物理图谱构建、BAC-FISH、光学作图、转基因研

5、究、基因的图位克隆、比较基因组研究、基因1.1　材料[3-4]组测序、着丝粒的研究等方面得到广泛的应用。实验仪器：96针式DNA复制器（NelgeNuncInternational鲤作为基因组最大的鱼类，在进化上具有重要Corp.）由美国加州儿童医学院周一博士友情提供。的研究价值。目前国内外尚未开展对鲤整个基因组BIO-RADmicropulser电转化仪，BIO-RAD公司产品。Gene的研究。根据鲤生产实际和市场的需求，提高鲤的AmpPCRSystem9700PCR仪，EppendorfMastercycler品质和适应性是目前亟待解决的问题。鲤良种选育Gradient梯度PC

6、R仪，GeneGeniusBioImagingSystem凝收稿日期：2008-03-06；修订日期：2008-06-20.基金项目：国家计划（973）项目“重要养殖鱼类品种改良的遗传和发育基础研究”（2004CB117405）；黑龙江水产研究所基本科研业务费项目“鲤鱼BAC基因组文库克隆”（2007HSYZX-SJ-12）.作者简介：耿波（1975-），女，助理研究员，博士，从事鱼类分子生物学研究.E-mail：ppgeng@sohu.com通讯作者：孙效文（1955-），博士生导师，研究方向：鱼类基因工程.E-mail：sunxw2002@163.com166中国水产科学第16

7、卷胶成像系统，为基因有限公司产品。DY-4B型交变脉量，可将1/4的胶块用脉冲场凝胶电泳（Pulsed-field冲电泳仪，江苏省兴化市分析仪器厂。核酸自动工作gelelectrophoresis，PFGE）来检测。1％琼脂糖胶，站（roboticliquidhandlingsystem）MultiPTOBEⅡPLOS，0.5×TBE，转换时间10～60s（6V/cm）脉冲，14℃室[5-6]PERKINELMER公司，USA。试剂购自上海生物工程温。使用λMarke