青石斑鱼B淋巴细胞刺激因子BAFF及斑马鱼TNFSF14的克隆、表达及生物学功能研究

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1、学位论文独创性声明本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究成果。本论文中除引文外，所有实验、数据和有关材料均是真实的。本论文中除引文和致谢的内容外，不包含其他人或其它机构已经发表或撰写过的研究成果。其他同志对本研究所做的贡献均己在论文中作了声明并表示了谢意。学位论文作者签名：旧覆萎日期：印nn拓学位论文使用授权声明研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属南京师范大学。学校有权保存本学位论文的电子和纸质文档，可以借阅或上网公布本学位论文的部分或全部内容，可以采用影印、复印

2、等手段保存、汇编本学位论文。学校可以向国家有关机关或机构送交论文的电子和纸质文档，允许论文被查阅和借阅。(保密论文在解密后遵守此规定)保密论文注释：本学位论文属于保密论文，密级：——保密期限为——年。学位论文作者签名：、锣缓薹指导教师签名：日期：pJ各．j‘’．≯‘日期：像妖仓矽，弓．岁、≯．7摘要B淋巴细胞刺激因子(BAFF)和T细胞上可诱导表达的、与HSv的糖蛋白D竞争结合HvEM的淋巴毒素类似物(LIGHT)都是TNF超家族的重要成员。BAFF广泛参与B淋巴细胞的生长、发育和分化，LIGHT能够刺激T淋

3、巴细胞的增生、诱导和调节肿瘤细胞凋亡等功能，二者在淋巴器官的发生、自身免疫病、抗病毒免疫等均发挥重要作用。到目前为止，对于石斑鱼BAFF基因和斑马鱼LIGHT基因的研究在国内外还处于空白状态。1、青石斑鱼B淋巴细胞刺激因子的克隆、表达及其生物活性的研究。本实验通过RT—PCR和RACE技术，从青石斑鱼脾脏组织中扩增得到B淋巴细胞因子(EaBAFF)的全长cDNA序列，该基因全长1442bp，包括5’和3’端非编码区以及780bp的开放阅读框(编码259个氨基酸)。与其它物种已知BAFF特征相同，EaBAFF的

4、氨基酸序列也含有一个预测跨膜区、潜在的弗林酶切位点、三个半胱氨酸残基、一个典型的TNF结构域。预测的三维结构与人的三维结构极其相似。实时定量PcR表明EaBAFF主要表达在青石斑鱼脾脏中。pET28a—EasBAFF质粒在大肠杆菌BL2l(DE3)中高效表达了l{is。一EasBAFF融合蛋白，对镍柱纯化得到的融合蛋白进行sDs—PAGE和westernblot分析鉴定。激光共聚焦结果显示该蛋白可以与青石斑鱼和小鼠的淋巴细胞表面的受体结合，体外wST一8检测表明His。一EasBAFF能够促进青石斑鱼淋巴细胞

5、和小鼠B淋巴细胞的存活。我们的研究结果或许能够为青石斑鱼免疫系统的研究提供理论依据，EasBAFF有可能作为免疫增强剂增强鱼体抵抗力。2、斑马鱼LIGHT的克隆、表达及活性分析。应用RT—PcR技术，从斑马鱼脾脏组织中扩增的到LIGHT的全长CDS序列，zLIGHT的开放阅读框为708bp，编码235个氨基酸。zLIGHT含有预测跨膜区以及典型的胞外TNF结构域。实时定量PCR表明zLIGHT主要表达在斑马鱼脾脏和肾脏，DSUM0一zsLIGHT质粒能够在大肠杆菌BL2l(DE3)中高效可溶表达，系统进化树分

6、析显示斑马鱼在进化地位上属于鱼类分支，SDS—PAGE和westernbloL分析进一步鉴定了该蛋白。激光共聚焦结果显示该蛋白可以结合到T淋巴细胞表面。斑马鱼有可能成为进一步研究LIGHT基因的模式动物。关键词：BAFF，LIGHT(TNFsFl4)，青石斑鱼，斑马鱼，B淋巴细胞——竺坐!壁一—————●—————_●————_——————_—————__————————————————_—————-————————————————●_—————一一AbstractBcellactivatingfactor(

7、BAFF)andlymphotoXin—like，exhibitsinducibleexpression，andcompetcswithHSVglycopmteinD(gD)forHVEM，areceptorexpressedbyTlymphoc”es(LIGHT)aretwoimponlantmembersoftheTl、『Fligandsuperfamily．BAFFextensiveparticipateinregulatingperipheralBlymphocytesactivation，proli

8、feration，aIlddi仃erentiation，LIGHTcanproVidecostimulato科sigllalstoTcellsandinducetheapoptosisofsometumorceIlIines．Theyplayimp咖ltroleinlymphoido唱aIlogenesis，auto—immunitydiseaSesandant沁iranmmunity-TheshJ