敲减Anp32a通过下调JNKP38MAPKs活性抑制多柔比星诱导的心肌细胞凋亡

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3、敲减Anp32a经MAPKs通路抑制多柔比星诱导的凋亡。方法：原代心肌细胞培养并运用肌钙蛋白I(cTnI)对其进行鉴定。实验分组：正常心肌细胞组(CMs组)、多柔比星(DOX)组、空载病毒(NC—LV)组、空载病毒+多柔比星(NC—LV+DOX)组、目的基因病毒(Anp)组、目的基因+多柔比星(Anp+DOX)组。将构建的lentivirus-scrRNAi和lentivirus—Anp32a／GVl15一RNAi载体分别转染入NC—LV组、NC-LV+DOX组和Anp组、Anp+DOX组。转染72h后应用免疫荧光法检测其转染心肌细胞的效率，并于DOX组、NC-LV+DOX组和Anp+DOX

4、组加入多柔比星(1umol／L)作用12h建立心肌细胞凋亡模型，应用AnnexinV—FITC法检测6组心肌细胞凋亡率，以心肌细胞凋亡率作为心肌细胞凋亡的观察指标，观察敲减Anp32a对多柔比星诱导的心肌细胞凋亡的影响。运用Westernblot法检测CMs组、DOX组、Anp组和Anp+DOX组的ERKl／2、p-ERKl／2、JNK、p-JNK、P38MAPKs、p-P38MAPKs蛋白表达水平。数据运用SPSSl3．O统计软件包进行多组间单因素方差分析和组间t检验。结果：体外原代培养的心肌细胞，呈多边形、梭形等，部分细胞聚集成细胞簇，呈放射状排列的同心圆状，搏动呈同步性，搏动频率多为6

5、0-100次／分。对细胞进行cTnI鉴定显示85％以上细胞呈阳性表达，符合心肌细胞特征。转染NC-LV和Anp32a敲减重组慢病毒心肌细胞72h后，荧光显微镜观察分别发现90％和80％以上的心肌细胞表达绿色荧光蛋白。分析AnnexinV—FITC法测定DOX组和CMs组心肌细胞凋亡率[(31．94±1．24)％VS(3．62±0．53)％，(p0．05)]、[(33．14±1．57)％VS(31．94

6、±1．24)％，(p>O．05)]，提示慢病毒对心肌细胞的毒性不影响结果分析；分析Anp+DOX组与DOX组凋亡率[(16．62±2．07)％VS(31．94±1．24)％，(p<0．05)]，说明敲减Anp32a能部分抑制多柔比星诱导的心肌细胞凋亡。分析DOX组与CMs组p-ERKl／2／ERKl／2比值未见明显差异，摘要无统计学意义(p>O．05)，说明多柔比星未引起ERKl／2活性的变化；DOX组与CMs组p-JNK／JNK比值高了1．5倍，差异有统计学意义(p(O．05)，说明多柔比星通过增加JNK的活性诱导心肌细胞凋亡；DOX组与CMs组p—P38／P38MAPKs比值高了0．9倍

7、，差异有统计学意义(p