抑制骨髓间充质干细胞旁分泌转化生长因子-β1对多柔比星致心肌细胞凋亡的影响

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1、江苏大学硕士学位论文抑制骨髓间充质干细胞旁分泌转化生长因子－－β1对多柔比星致心肌细胞凋亡的影响姓名：陈星申请学位级别：硕士专业：内科学指导教师：张国辉20120601江苏大学硕士学位论文摘要目的：通过抑制骨髓间充质干细胞(MSCs)旁分泌转化生长因子．p1(TOF．13。)对多柔比星(DOX)受损心肌细胞的作用，观察心肌细胞凋亡水平的改变，并探索其可能机制，为进一步提高MSCs移植治疗的有效性提供理论依据。方法：(1)用酶消化法和差速贴壁法分离、纯化新生SD大鼠心肌细胞。用全骨髓贴壁法分离培养SD大鼠MSCs。(2)用不

2、同浓度DOX(0．5、l、2lamol／L)处理培养第3天的心肌细胞，对各浓度组的不同时间点(4、12、24、48h)进行检测，建立DOX心肌细胞损伤的体外模型。(3)将培养第3天的心肌细胞随机分为三组：A组，正常对照组；B组，DOX损伤组；C组，TGF．13l干预组。同时建立MSCs与心肌细胞共培养体系，并分为三组：D组，DOX损伤组；E组，DOX损伤+MSCs共培养组；F组，DOX损伤+MSCs+Ly364947(TGF．13l受体特异性抑制剂)共培养组。(4)0c．横纹肌肌动蛋白(O【．SA)免疫细胞化学染色法鉴定心

3、肌细胞纯度，流式细胞仪检测培养第三代的MSCs的表面标志CD90和cD45。MTT法检测心肌细胞存活率，流式细胞术AnnexinV／PI双染法检测各组心肌细胞凋亡率，ELISA法检测心肌细胞和MSCs上清中TGF—p1的浓度，Westernblot法检测各组心肌细胞Caspase．9的蛋白表达。结果：(1)用酶消化法和差速贴壁法可分离获得状态良好、纯度高的心肌细胞，培养第三天的。tl,肌细胞纯度达90％。用全骨髓贴壁法可获得纯度高、活力好的MSCs，培养第三代的MSCs纯度达90％。(2)和正常心肌细胞相比，21．tmol

4、／LDOX诱导4h即可使心肌细胞存活率显著下降[(80．534-1．92)％VS100％，P<0．01]；2I．tmol／LDOX可诱导心肌细胞凋亡，在4h-48h内细胞凋I江苏大学硕士学位论文亡率不断增JJn[对照组(1．394-O．18)％、4h组(3．654-0．49)％、12h组(8．544-O．64)％、．24h组(11．704-1．62)％、48h组(17．804-1．67)％，P<0．05】；2I-tmol／LDOX诱导心肌细胞4h后，TGF．13l蛋白表达量与对照组之间无明显差异【(2．374-0．21)n

5、g／Lvs(2．234-O．15)ng／L，P>0．05】，而在12h--,48h内TGF-pl蛋白表达量明显增力l[12h组(2．714-O．12)ng／L，24h组(3．164-0．46)ng／L，48h组(3．604-0．18)ng／L，P<0．05]，且与心肌细胞凋亡率呈正相关，r=0．932。(3)与A组相比，B组心肌细胞凋亡率增)J1[(49．154-7．05)VS(27．034-4．43)％，P<0．05】；而加入TGF．13l后，C组较B组心肌细胞凋亡率进一步增}Jl[(71．704-5．17)VS(49．

6、154-7．05)％，P<0．051。(4)第三代的MSCs可分泌一定量的TGF-pl，检测细胞上清中TGF．13l的浓度为(3．274-0．31)ng／L。(5)成功建立MSCs与DOX损伤心肌细胞的共培养体系。ELISA法检测各组细胞上清中TGF一13I的含量：E组较D组TGF—pl表达量增加【(5．334-O．55)VS(2．784-O．14)ng／L，P<0．05]，F组较E组TGF．13l表达量减少【(3．414-O．46)VS(5．334-O．55)nedL，P<0．05]。AnnexinV．FITC／PI流式

7、细胞仪检测各组心肌细胞凋亡率：E组较D组心肌细胞凋亡率下降[(60．704-2．20)VS(69．844-2．84)％，P<0．05]，F组较E组凋亡率进一步下降[(51．58士5．11)VS(60．704-2．20)％，P<0．05]。WesternBlot检测各组心肌细胞Caspase．9蛋白表达水平：E组较D组Caspase．9蛋白表达水平下降[(0．587士0．003)VS(0．6714-0．005)，P<0．05]，F组较E组Caspase-9蛋白表达水平进一步下降[(O．4564-0．002)VS(O．5874

8、-0．003)，P<0．05]。结论：MSCs可以通过旁分泌效应减少DOX引起的心肌细胞凋亡，但其旁分泌的细胞因子TGF—pI在DOX诱导的心肌细胞凋亡中起促进作用。特异性抑韦ITGF．p。的作用，可以进～步降低心肌细胞凋亡率，更大程度上提高MSCs江苏大学硕士学位论文的移植效率，其机制可能与抑带lJC