gata4基因对促进骨髓间充质干细胞旁分泌作用地研究

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1、IIIGATA-4基因对促进骨髓间充质干细胞旁分泌作用的研究摘要目的：从旁分泌作用机制上探讨GATA-4过表达对骨髓间充质干细胞(MesenchymalStemCells，MSCs)存活的影响。方法：1.用贴壁培养法分离纯化Spraque-Dawley(SD)大鼠骨髓MSCs，并用流式细胞仪对其表面标志进行鉴定。GATA-42.用pMSCV逆转录病毒表达系统将GATA-4基因转染MSCs（MSC），并null将空质粒（MSC）作为对照。3.采用实时定量PCR(Real-timequantitativePCR，RT-PCR)、WesternBlot和免疫组化方法分别检测GAT

2、A-4的mRNA和蛋白质在各组MSCs中的表达情况。Null4.根据氧浓度及转染质粒情况，将培养的MSCs分成：常规氧组：MSCs、MSCGATA-4NullGATA-4和MSC组；缺氧组：MSCs、MSC和MSC组。5.收集各组MSCs的培养上清液，采用酶联免疫吸附试验（Enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）检测各组MSCs中的血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)、肝细胞生长因子(hepatocytegrowthfactor,HGF)和胰岛素样生长因子-1(insulingrowt

3、hfactor-1,IGF-1)。6.MSCs培养48h后，用MTT比色法检测细胞增殖，膜联蛋白V染色法检测细胞凋亡，乳酸脱氢酶（lactatedehydrogenase，LDH）释放量检测细胞损伤，来评价各组MSCs的存活情况。7.加入VEGF和IGF-1中和抗体后再培养48h，再次使用上述相同方法评估各组IMSCs的存活情况。结果:1.成功分离纯化骨髓MSCs，细胞接种24h后开始贴壁，呈较大的椭圆形，48h后细胞贴壁逐渐增多，呈均匀一致的长梭状，方向较规律，呈平行或旋涡状生长；2.实时定量PCR、WesternBlot和免疫组化方法结果显示GATA-4的mRNA和GA

4、TA-4蛋白质在MSC组中呈过量表达。3.缺氧状态下细胞比常规氧下细胞分泌VEGF、HGF和IGF-1明显增多（PGATA-4null<0.05）；常规氧下，MSC组VEGF和IGF-1的表达量明显较MSCs和MSCGATA-4组升高（P<0.05），而HGF表达量未见明显差异（P>0.05）；缺氧状态下，MSCnull组的VEGF和IGF-1的表达量明显较MSCs和MSC组升高（P<0.05），而HGF表达量未见明显差异（P>0.05）。4.与加入抗体之前相比，分别加入VEGF和IGF-1中和抗体后，各组细胞的MTT摄取率均降低，膜联蛋白V阳性细胞率和LDH释放量均升高（

5、P<0.05）；缺氧nullGATA-4状态下，加入中和抗体后，与MSCs和MSC组相比，MSCMTT摄取率较高，null膜联蛋白V阳性细胞率和LDH释放量均较低（P<0.05）；缺氧MSCs与缺氧MSC组比较，存活情况差异无统计学意义（P>0.05）。结论：1.通过基因转染技术可以成功将骨髓MSCs高效过量表达GATA-4。2.过表达GATA-4的骨髓MSCs可以促进其分泌VEGF、HGF和IGF-1。3.加入VEGF和IGF-1中和抗体后MSCs存活明显受抑制，而GATA-4过表达可以改善细胞存活，推测GATA-4通过干扰MSCs的旁分泌机制影响细胞的存活。4.GATA

6、-4基因转染MSCs可通过影响旁分泌作用促进细胞存活，可为MSCs移植治疗缺血性心脏病提供新的方法。关键词：GATA-4；骨髓间充质干细胞；旁分泌作者：黄美娇指导老师：陈弹教授IIStudyonGATA-4geneinimprovingtheparacrineeffectofbonemarrowmesenchymalstemcellsAbstractStudyonGATA-4geneinimprovingtheparacrineeffectofbonemarrowmesenchymalstemcellsAbstractObjective:Toinvestigatetheef

7、fectofover-expressedGATA-4ontheparacrineeffectofmesenchymalstemcells(MSCs).Methods:1.MSCswereisolatedandculturedbyadherentculturemethodandidentifiedbyflowcytometer(FCM).GATA-42.MSCsweretransfectedwithGATA-4(MSC)byusingapMSCVretroviralnullexpressionsystem,andnu