骨髓间充质干细胞促进皮肤创伤愈合的研究

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1、骨髓间充质干细胞促进皮肤创伤愈合的研究【摘要】目的：探讨骨髓间充质干细胞（MSCs）在组织工程皮肤修复创面缺损中的作用.方法：以标记了PKH26的MSCs为种子细胞构建组织工程皮肤，修复皮肤缺损，HE染色和免疫组织化学染色观察愈合效果，荧光检测追踪细胞转归.结果：移植2esenchymalstemcells，MSCs）是近年来研究的一个热点，它来源于中胚层，有较强的自我更新和增殖能力，且取材方便，易于培养，不涉及伦理道德等问题，因而被认为是组织工程理想的种子细胞〔1〕.本研究拟用MSCs作为种子细胞经体外培养扩增后构建组织工程皮肤，修复动物皮肤缺损，观察修复效果及细胞在体

2、内的分化，为构建具有生理功能的组织工程皮肤奠定基础.　　1材料和方法　　1.1材料　　无菌条件下从猪髂骨处抽取骨髓，采用Percoll（Sigma）分离法，经密度梯度离心收集界面层的单个核细胞，PBS洗两次，离心收集细胞，重悬于体积分数为100mL/L胎牛血清的DMEM/F12培养液进行培养，隔日换液，弃去未贴壁的细胞，待贴壁细胞继续培养达80%~90%融合时，用胰蛋白酶消化，传代培养.使用前用PKH26荧光染色试剂盒（Sigma）进行荧光标记.标记好的细胞在荧光显微镜下呈单个类圆形的红色光点，显示较强的荧光.取用荧光标记过3~5代状态良好的骨髓间充质干细胞，以1.8×1

3、06/mL的密度与提取自小牛皮的Ⅰ型胶原混合，37℃孵育30min凝固后，加入培养液培养，2d将其移至气液面进行器官培养，继续培养2d获得含有MSCs的组织工程皮肤〔2〕.　　1.2方法　　1.2.1动物创伤模型制备及移植实验　　实验用猪6只，雌雄不限，质量17~20kg.麻醉后背部剃毛，消毒.在每只猪脊柱两侧皮肤各制备2个直径50mm的圆形皮肤缺损，深至筋膜层，建立深层皮肤缺损动物模型（n=24），自体双侧对照，左右随机分为实验组和对照组.实验组将构建的组织工程皮肤覆盖创面，敷以无菌油纱和普通纱布，打包缝合.对照组创面未覆盖组织工程皮肤，其它治疗同实验组.术后1SCs复

4、合的组织工程皮肤与自体皮肤较好的融合，移植物颜色与自体皮肤颜色接近，随着时间延长，移植物中毛细血管的数量逐渐增多，上皮角化不明显；移植后2wk，创面基本愈合，移植物颜色与自体皮肤颜色非常接近，瘢痕小，上皮增厚，角化明显，真皮层细胞生长良好，毛细血管大量增生.对照组未完全愈合，移植区瘢痕形成，颜色较深，到移植后第3wk才以瘢痕愈合.实验组和对照组创面的愈合时间分别为（14.2±1.5）d和（20.4±2.7）d，两组间差异有显著性（P0.05）.我们对新形成皮肤组织中的毛细血管进行了计数，发现在第6wk实验组明显高于对照组（P0.05,图1）.　　2.4荧光检测荧光显微镜对

5、实验组的组织标本进行连续检测6wk，可在皮肤组织的表皮层，真皮层和皮下脂肪层的血管周围观察到标记了红色荧光的细胞.　　2.5免疫组织化学检测术后6anmesenchymalstemcells〔J〕.Science,1999,284(5411):143-147.　　〔2〕金岩,吕红兵,刘源,等.人全层组织工程皮肤的研制〔J〕.实用口腔医学杂志,2002,18(2):163-167.　　〔3〕LazarusHM,Haynesanbonemarroalprogenitorcells(mesenchymalprogenitorcells):Implicationsforthera

6、peuticuse〔J〕.BoneMarroarcJ,etal.Participationofbonemarroentofchronicarroatol,2003,139(4):510-516.　　〔6〕Nakagaanmesenchymalstemcellssuccessfullyimproveskinsubstituteatol,2005,153(1):29-36.　　〔7〕RasulovMF,VasilchenkovAV,OnishchenkoNA,etal.Firstexperienceoftheusebonemarroesenchymalstemcellsfo

7、rthetreatmentofapatientarroalcellsthroughgrowthfactorproduction〔J〕.JSurgRes,2006,136(2):336-341.