骨髓间充质干细胞移植治疗急性心肌梗死旁分泌效应的实验研究

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1、中国人民解放军军医进修学院;中国人民解放军总医院博士学位论文骨髓间充质干细胞移植治疗急性心肌梗死旁分泌效应的实验研究姓名：马晓辉申请学位级别：博士专业：外科学（胸心血管外科）指导教师：高长青;李力兵20080605军医进修学院博士学位论文骨髓间充质干细胞移植治疗急性心肌梗死旁分泌效应的实验研究(中文摘要)一、实验目的：1、完成大鼠骨髓问充质干细胞(MSCs)的体外培养、传代，研究不同剂量的60Co丫射线对MSCs增殖的影响，观察5-aza能否诱导MSCs分化为心肌样细胞及射线对其分化能力的影响。2、建立大鼠急性心肌粳死(AMI)的模型，探讨MSCs移植治疗AMI的可行性，评

2、价经照射和未照射处理的MSCs移植后对大鼠心梗后心脏形态、结构及功能的影响，并检测MSCs移植后其分泌的细胞因子(VEGF，bFGF、IL．1J3)在心肌内表达的变化。3、研究体外培养的经不同剂量射线照射的MSCs分泌细胞因子(VEGF、bFGF、IL．1D)的变化，评价心肌内注射MSCs培养上清液，并定期给与腹腔内注射后，对大鼠心梗后心脏形态、结构及功能的影响，初步探讨其作用机制。二、实验方法：1、取冻存的第一代大鼠MSCs采用贴壁培养法进行细胞培养、传代，取第3代MSCs行60CoY射线照射(剂量为2Gy、4Gy、8Gy、12Gy)，结晶紫染色观察生长情况和细胞形态。培

3、养4周后行台盼蓝染色排斥试验观察MSCs的存活情况，MTT比色试验检测其增殖能力的变化。另取4Gy照射组及未照射组MSCs加入5-aza诱导分化4周，RT-PCR检测C．TNT、p．MHC的表达。2、50只大鼠随机分为心梗对照组、MSCs移植组、照射MSCs(4Gy)移植组，术前超声检查心功能，采用开胸冠状动脉结扎法建立AMI模型，心梗1h后分别注射两种MSCs，同步记录ECG变化。术后4周行超声和血流动力学检测心脏大小和心功能变化，RT-PCR检测VEGF、bFGF、IL—lp在心肌内的表达，心脏标本行HE染色，并行VIII因子免疫组化染色比较不同组微血管密度的差异。军医

4、进修学院博士学位论文3、收集各组MSCs照射前及照射后第一次换液的培养液，用ELISA法检测各组上清液中VEGF、IL．1p、bFGF含量的变化。4、30只大鼠随机分为注射上清液组和培养基组，除了采用RT-PCR和ELISE两种方法检测VEGF、bFGF、IL．1D在心肌组织内的表达外，其他实验步骤、方法及检测指标同实验第二部分。三、实验结果：1、未照射组、2Gy和4Gy组细胞生长良好，8Gy和12Gy组细胞全部死亡。2Gy组细胞增殖能力未受到影响，而4Gy组细胞增殖能力受到抑制，且持续3周以上。未照射组和4Gy照射组经5-aza诱导，4周后未发现心肌样细胞，未见细胞融合及

5、肌管形成，但C．TNT和p-MHC在未照射组有所表达，而4Gy组无表达。2、第二部分大鼠心梗模型成功率74％，存活率66％。心脏超声各项指标(LVEF、LVDd、LVDs、FS)三纽都明显低于术前，两细胞移植组较心梗对照组术后心功能明显改善、心脏缩小。两细胞移植组的各项血流动力学指标LVSP、LVEDP、+dp／dt。麟、-dp／dtmin明显好于心梗对照组。两细胞移植组三种细胞因子表达明显增加，而对照组未检测到。VIII因子免疫组化染色微血管计数对照组明显少于两细胞移植组。3、不同剂量照射后三种细胞因子表达同照射前相比都下降，且随着照射剂量的增加，细胞因子分泌量下降明显。

6、4、第三部分心梗模型成功率83．3％，存活率73．3％。超声和血流动力学检测上清液组各项指标明显好于培养基组。上清液组检测心肌组织三种细胞因子表达增加，ELISA法能检测到培养基组和心梗对照组三种细胞因子少量表达。VIII因子免疫组化染色微血管计数值上清液组显著高于培养基组。四、实验结论：l，体外培养的MSCs对60CoY射线比较敏感，辐射剂量达到一定程度(4Gy)后会影响MSCs的活力和增殖能力，表现为其活力和增殖能力明显受到抑制，8Gy以上大剂量照射后导致MSCs全部死亡。小剂量的60Co^r射线(4Gy)照射会抑制或损伤大鼠MSCs的分化能力，可能是损伤或者暂时抑制这

7、种能力。军医进修学院博士学位论文2、移植丧失分化能力的MSCs及正常MSCs都能明显改善心梗后早期的心功能。MSCs移植后在心肌内能表达多种细胞因子如(VEGF、bFGF和IL一1D)，单独注射这些细胞因子同样能够改善心功能，可见MSCs移植能够改善心梗后早期的心功能，MSCs的旁分泌效应起到了主要作用。旁分泌的作用机制很复杂，促新生血管形成是其中重要的环节。3．体外培养的MSCs能分泌多种细胞因子，60CoY射线照射能影响MSCs的旁分泌功能。随着照射剂量的增加，细胞因子分泌量下降明显．关键词：细胞移植，心肌梗死