甘蔗内生固氮菌的分离鉴定及16SrRNA基因克隆和序列分析

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1、摘要本文首先用无氮培养基从福州甘蔗栽培品种的根部进行内生固氮菌的分离、纯化和筛选，并采用乙炔还原法对这些菌株进行固氮酶活性测定；其次对分离出的菌株进行生理生化指标测定和16SrRNA基因克隆和序列分析；同时研究了在不同环境因子作用下少动鞘氨醇单胞菌的生长特性；最后，采用三亲交配法将nO'H-gfp融合荧光蛋白标记基因导入固氮菌少动鞘氨醇单胞菌，将其回接到甘蔗中，利用激光共聚焦扫描显微镜对其进行了观察。研究结果表明：实验分离到了12株形态大小、质地各异的菌株；固氮酶活性测定结果显示6株固氮酶活性较高，其中少动鞘氨醇单胞菌固氮

2、酶活性为最高；在对12株菌16SrRNA基因的序列分析的基础上，建立了系统发育树，确定了菌株分类学地位及进化亲缘关系；在不同环境因子作用下，少动鞘氨醇单胞菌在生长时对这些处理有较广的适应性，对温度和pH的适应范围较大，在15．40℃，pH4．5．9．0范围内均能生长，并且具有很强的耐铵能力，而且对高渗透压环境也有很强的适应性；显微观察表明固氮菌主要定殖在甘蔗根的内皮层细胞，回接结果显示接种少动鞘氨醇单胞菌的甘蔗苗与未接菌的对照相比，株高提高了87．19％，鲜重增加了119．88％。关键词：甘蔗内生固氮菌，分离，鉴定，基因克

3、隆，序列分析中文文摘甘蔗是热带、亚热带禾本科C4植物，是主要的制糖原料，也可以用它生产工业酒精。世界上甘蔗种植面积最大的国家是巴西，其次是印度，中国位居第三，在中国主要分布在广西、广东、福建、台湾、四川、云南、江西、贵州、浙江、湖南、湖北等省份。氮元素是空气中的主要成分之一，游离型的氮气不能被大多数生物直接利用，必须还原成氨类化合物才能被生物所利用，在这个生化反应过程中生物固氮发挥了重要作用。生物固氮占地球上固氮总量的90％，对维持地球生态平衡有着重要意义。除了豆科植物，目前在甘蔗、玉米等作物上也发现了有固氮微生物存在。利

4、用固氮生物的白生固氮能力进行固氮，不仅提高固氮效率，而且可以节省大量能源。甘蔗是南方地区的经济作物，种植面积非常大。对生物固氮进行研究，对于缓解能源短缺和解决农业生产中造成的环境污染等问题，具有重要意义。如果能在甘蔗体内分离出固氮能力强的固氮菌，并对其进行研究，构建出工程菌株，对于解决当前农业生产的实际问题开辟了一个新的途径。国内外学者在内生固氮菌的研究中，已经取得了很多有意义的进展。1986年Barbara从卡拉草内分离到了固氮弧菌(Azoarcussp．)，可用于牧草生产中；1987年巴西Dobereiner实验室从甘

5、蔗体内分离到醋酸固氮菌(Acetobacteriazotrophicus)，该菌株具有非常高的固氮能力，可以提供甘蔗生产中五分之三的氮元素；我国学者在水稻和玉米内生固氮菌的研究中，做了大量工作，1981年丘元盛等从广东水稻根中分离出粪产碱菌和阴沟杆菌，尤崇杓对它们的生理特性及其与水稻的相互作用开展了深入研究，采用分子生物学方法构建了水稻固氮工程菌株。前人的研究工作给我们很多重要启示，我们从福州本地现有主要甘蔗栽培品种的根部进行固氮菌的分离，纯化得至IJl2株形态大小质地各异的菌种，用乙炔还原法测定菌种固氮酶活性，获得6株酶

6、活较高的菌株。对分离出的菌株进行生理生化指标初步鉴定；用分子生物学技术对这些细菌的16SrRNA基因进行克隆，并对基因序列进行了分析，建立了系统发育树，在进化上确立了菌株间的亲缘关系。16SrRNA基因序列分析结果与生物梅里埃公司WIPEK32鉴定仪生理生化测定结果以及形态学观察的结果一致，且经判定这些菌株均是属于固氮菌属。将12株菌的16SrRNA基因序列提交至lJGenbank数据库，获得了序列号：EU931548、EU931549、EU931551、V福建师范大学硕士学位论文EU931552、EU931553、EU9

7、31555、EU931557、EU931559、EU931560、EU931561、EU931563、EU931564。从甘蔗根部分离鉴定到了10个种属的固氮菌：铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、短芽孢杆菌(BacillussubHlis)、嗜麦芽糖寡养单胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)、肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种(klebsiellapneumoniassp．Pneumoniae)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、成团泛菌(Pantoeaagglo

8、merans)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)、藤黄微球菌(Micrococcusluteus)、少动鞘鹌鹑单胞菌(Sphingomonaspaucimobilis)。我们还对温度、酸碱度、铵盐浓度、蔗糖浓度、渗透压等不同环境因子处理