乳酸片球菌16srrna基因和片球菌素基因克隆及序列的分析

《乳酸片球菌16srrna基因和片球菌素基因克隆及序列的分析》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、摘要细菌素是乳酸茵产生的具有抗菌活性的蛋白或多肽，有作为安全高效食品防腐剂的良好应用前景。本试验对以往从发酵食品中分离出的一株乳酸菌进行了鉴定，用生理生化试验确认其为乳酸片球菌，并发现该菌株具有杀死单核细胞增多症李氏杆菌的作用。经蛋白水解酶试验、对过氧化氢酶试验、有机酸排除试验等认为该菌产生的抗菌物质为抗菌肽，即细菌素。根据GenBank(X95976)公布发表的Pediococcusacid16SrRNA基因序列，设计并合成一对特异引物，采用PCR技术，扩增出16SrRNA片段，并将该片段定向克隆于克隆测序pUCm．T载体上。经PCR、

2、限制性内切酶酶切验证筛选，最后对阳性的转化子提取质粒进行DNA序列的测定与分析，同源性为99％，进一步从基因分子水平鉴定了分离株为乳酸片球菌。为了探索乳酸片球菌的抗菌机理，从分子水平检测是否有片球菌素操纵子的存在，本试验根据GenBank(AccessionnumberM83924)公布发表的Pediococcusacid结构基因序列，设计合成了3对特异引物，采用PCR技术，扩增出目的片断，并将片段定向克隆于克隆测序pTA2载体上。经PCR、限制性内切酶酶切验证筛选，最后对鉴定为阳性的转化子提取质粒进行DNA序列的测定与分析，发现该乳酸片

3、球菌素操纵子大小为5595bp，含有4个主要的基因，分别是心dA、PedB、胱、和PedD基因，与GenBank发表的乳酸片球菌操纵子基因相比同源性达到99．9％，在第1688个碱基变异，导致R瞄因一个氨基酸的改变，这就从分子水平说明了该菌抗菌活性是由操纵子基因编码实现的。经试验发现，我们分离的乳酸片球菌细菌素产量较低，不适合进行产业化开发。本试验提取乳酸片球菌的全基因组作为模版，根据GenBank(M83924)发布的pediocinPA．1结构基因序列设计合成一对特异引物，采用PCR技术，从基因组DNA中扩增出目的片段，并将该片段定向

4、克隆于克隆测序载体上。经验证筛选，最后对鉴定为阳性的转化子进行核苷酸序列测定与分析，然后克隆到表达载体pET-28a，转化EcohT)H5Q，经过kana+平皿筛选，质粒酶切，PCR两步验证，获得阳性重组质粒，并转化表达宿主菌E．coliBL21，以异丙基硫代．13．D．半乳糖苷(IPTG)诱导表达，Tricine．SDS．PAGE电泳，显示在4600Da左右出现条带，与己预期的细菌素分子量大小符合。关键词：乳酸片球菌细菌素16SrRNA克隆表达ABSTRACTBacteriocinisantimicrobialpeptideorprot

5、einproducedbyLacticacidbacteriawhichattractedinterestasapotentialbiopreservativeinfoodsysterms．AisolatedstraincouldagainstListeriamonocytogenes．Thestrainthroughtraditionaltaxonomymethods’examinateisPediococcusacidilactici．Thestrainwasfoundtoproduceextracellularantimicrobi

6、alsubstance．Theantimicrobialpeptideisassayedasnonorganicacidandnonhydrogenperoxide．Itissensitivetoproteolyticenzymes，resistanttoheat，andactiveoverawiderangeofpH．Thenthroughappraisalof16SrRNAsequenceanalysis．Designedtheoligonucleotideprimersaccordingtothegenesequencereport

7、edbyGenBank(X95976)．AmpliedtheDNAfragmentbymeansofPCRandclonedtOpUCm-TVectortosequenced．ComparedtheinsertedDNAfractionandthePediococcusacid16SrRNAsequencereported,foundsequencehomologywas99％．ResultshowedtheisolatedstrainwasPediococcusacidilactici．InordertoexploreP．acidila

8、ctici’Santibacterialmechanism,experimentexaminesifthisstrainhavethepediocinoperon．，wecoloneAthee