家蝇幼虫防御素基因的克隆和序列分析

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1、家蝇幼虫防御素基因的克隆和序列分析【摘要】目的：克隆家蝇幼虫防御素（defensin）基因并进行序列分析。方法：根据Genbank公布的家蝇成虫defensin基因序列设计一对引物，以家蝇幼虫基因组DNA为模板，进行PCR扩增、测序，并利用软件进行序列分析。结果：克隆得到的defensin基因的长度为330bp，编码92个氨基酸，4个阳性克隆的DNA序列编码的多肽在第27位氨基酸残基不同，为K或N。结论：从家蝇幼虫基因组DNA中克隆得到了defensin基因，发现了两种相差一个氨基酸残基的defensin前体蛋白，并初步预测了两种前体蛋白的化学

2、性质和二级结构，为该基因的重组表达奠定了基础。【关键词】防御素类；家蝇；幼虫；克隆，生物；序列分析　　［Abstract］Objective:ToclonethedefensingenesofMuscadomesticalarvaeandanalyzetheirsequences．Methods:PCRenticDNAofM.domesticalarvaeastemplate,andtheprimersusedesticaadultdefensingenesequenceinGenbank.ThePCRproductsidTvector,an

3、dsequenced.Results:Theamplifiedproductsinoacids.FiveSingleNucleotidedifferencesofsequencesexitedamongfourclones.TinoacidsequencesofdefensingeneM.domesticalarvaeinthisexperiment.Conclusion:DefensingeneofM.domesticalarvaehasbeenclonedsuccessfully.T;sequenceanalysis滥用抗生素带来了日益严重

4、的微生物对抗生素的耐药性问题，因此发现和筛选具有新的作用机理的抗菌药物已经成为当前医药研究领域的迫切任务。昆虫抗菌肽是一类生物活性小分子肽，具有热稳定性强、杀菌力强、抗菌谱广和无免疫原性的特点，可以抑杀某些真菌、细菌、病毒及原虫，并对多种癌细胞及动物实体瘤有明显的杀伤作用,且不会破坏正常细胞[1，2]，其突出的优势在医药领域展示出良好的应用前景，将成为新一代的抗菌、抗病毒、抗癌药物。家蝇(Muscadomestica)与其他昆虫相比对病原微生物有着更为强大的免疫力，大量的研究结果显示家蝇的强大免疫力正是因为体内存在着抗菌[3]、抗病毒[4]、抗

5、真菌[5]的活性分子。防御素（defensin）是抗菌肽家族中最为普遍的一类，并且在不同物种中有很高的保守性，具有广谱的抗菌和调节机体免疫系统的作用。由于天然抗菌肽的少，纯化工艺的难度与高成本，无法满足临床试用和基础研究的需要。因此，通过基因工程技术生产防御素，无疑是降低成本和大量生产的有效途径。近年来，王来城[6]和许琴英[7]分别通过构建cDNA文库先后克隆了广东家蝇幼虫和山东家蝇成虫的defensin基因，家蝇防御素在大肠杆菌和毕赤酵母中的表达也获得了初步成功[8，9]；王婷婷等[10]构建了有利于家蝇defensin基因高效表达的同向串

6、联表达载体。在这些研究中，家蝇防御素基因的获得均是通过从抽提家蝇RNA或是建立的cDNA文库中来扩增该基因，目前尚未见从家蝇基因组中克隆defensin基因的报道。本研究以贵州贵阳的家蝇幼虫作为实验材料，直接抽提幼虫基因组DNA，用PCR方法克隆defensin基因，并与其cDNA相比较，了解其基因结构，为下一步建立该基因高效稳定的表达体系奠定基础。　　1材料与方法　　1.1材料　　1.1.1家蝇幼虫　　由贵阳医学院昆虫分子生物学实验室提供。　　1.1.2E．coliJM109菌株　　本实验室保存的E.coliJM109菌株，Taq聚合酶、DN

7、AMarker、pMD-18T载体试剂盒、M13引物、限制性内切酶等购自大连宝生物公司，PCR引物由大连宝生物公司合成，其余试剂均为进口或国产分析纯。　　1.2方法　　1.2.1基因组DNA的提取　　取3只三龄幼虫，约30g，参照安春菊[11]的方法抽提幼虫基因组DNA。　　1.2.2PCR扩增和产物鉴定　　扩增反应体系为50μl，模板DNA1μl，10×PCRBuffer5μl，TaqDNA聚合酶0.5μl，25mmol/LdNTPs4μl，10μmol/L物引2μl，水35.5μl。PCR扩增程序为：94℃预变性2min后进入扩增循环，94

8、℃变性40s，56℃退火50s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。反应结束后，用1.5%的琼脂糖凝胶电泳0.5h,溴化乙锭染色法检