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《马铃薯y病毒(山东分离物)外壳蛋白基因克隆和序列分析1》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。
1、马铃薯Y病毒（山东分离物）外壳蛋白基因克隆和序列分析王秀芳1,2温孚江1竺小平1郭兴启1（1.山东农业大学植物保护学院，山东泰安，271018）(2.中国烟草总公司青州烟草研究所，山东青州，262500)摘要以马铃薯Y病毒山东分离物（PVY-SD）基因组RNA为模板，应用RT-PCR方法和特异引物合成了外壳蛋白基因。PCR产物经kpnⅠ和BamHⅠ酶切后克隆入pUC19转化大肠杆菌DH5α，经限制性酶酶切鉴定，重组克隆中含有与PCR产物大小相同的0.8kb的插入片段，cDNA全序列分析表明，PVY-S
2、DCP基因核苷酸序列与N株系的同源性为96%，与GENEBNAK中登录序列号为AJ390306的株系为O的同源性最高，达99%，亲缘关系最大。与国内不同学者报道的PVY中国流行株的同源性分别为96%，97%，98%。关键词:马铃薯Y病毒外壳蛋白克隆序列分析中图分类号:S432.4文献标示码:CLONINGANDSEQUENCINGOFTHEGENEENCODINGCOATPROTEINOFPOTATOVIRUSYINSHANDONGWang-xiufang1,2Wen-fujiang1Zhu-xiao
3、ping1Guo-xingqi1(1,collegeofplantprotectionofshandongagricultureuniversity,tai’an,271018)(2,QingzhouTobaccoInstituteofChinaNationalTobaccoCorporation,Qingzhou,262500)ABSTRACT:UsingtheRNAgenomeofPVY-SDandapairofprimersspecifictoPVY,RT-PCRwasperformed,asp
4、ecificfragmentof0.8kbcorrespondinginsizetothePVYcoatproteingenewasamplified.TheproductsofPCRwereclonedinpUC19inDH5α.Therecombinantclonewasidentifiedbyrestrictionmappingandthenucleotidesequencing.ThehomologiescDNAsequencebetweenPVY-SDCPandPVYNis96%,theen
5、codingsequencehadthehighesthomology(99%)tothatofPVYOwhoseregistrationnumberinGENEBANKisAJ390306,andthehomologiesofcDNAsequencebetweenPVY-SDCPandPVYhappenedinchinawhichdifferentauthorreportedwere96%,97%,98%.KEYWORDS:potatovirusY;coatprotein;clone;sequenc
6、ing马铃薯Y病毒（potatovirusY,PVY）是马铃薯Y病毒组的典型成员，其病毒粒体呈弯曲线状，含有大约10kb的单链正义RNA，只包含一个开放的阅读框架，该病毒的外壳蛋白基因位于3’非编码区的上游[1]。PVY主要危害马铃薯，烟草，番茄，辣椒等作物，造成严重的经济损失，因而选育抗PVY感染的作物品种具有重要意义。近几年发展起来的基因工程育种为培育作物的抗病毒新品种提供了新的途径。为了掌握山东省马铃薯Y病毒株系情况，我们获得了马铃薯Y病毒山东分离物（PVY-SD），并在此基础上对其外壳蛋白基因
7、进行了克隆和序列分析，试图为培育山东省抗PVY的工程植株打下基础。1材料与方法1．1材料马铃薯Y病毒山东分离物（PVY-SD）分离自山东省泰安市下港区感病的马铃薯上。AMV反转录酶，PCR试剂，限制酶系统，T4DNA连接酶购自宝生物工程（大连）有限公司。大肠杆菌DH5α，克隆载体pUC19由本实验室提供。1．2病毒RNA的提取从感染病毒（PVY-SD）3-4周的烟草病叶（N.tobacum,cv,samsun）中按文献［２］的方法提取病毒粒体．蛋白酶K裂解法经苯酚／氯仿萃取病毒，乙醇沉淀得到病毒RNA
8、。作者简介：王秀芳，女（1976-），硕士，联系地址：中国农业科学院烟草研究所,2625001.3RT-PCR扩增CP基因依据已发表的PVY核苷酸序列[3]，设计并合成了PVY外壳蛋白基因的寡核苷酸引物，上游端引物为：5’-GCGCGGATCCGCAAATGACACAATGGCATGCAG-3’下游端引物为：5’-GCGCGGTACCTCACATGTTCTTGACTCCAAGT-3’为了便于以后的遗传操作，在上游端引物中引入了BamHⅠ酶切位点（划底线部
