鸡贫血病毒apoptin蛋白编码基因的克隆和序列分析论文

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1、鸡贫血病毒Apoptin蛋白编码基因的克隆和序列分析论文刘德纯王健生王作仁段小艺陈武科杨广笑【摘要】目的：为了寻找肿瘤特异凋亡蛋白，克隆鸡法氏囊组织中鸡贫血病毒Apoptin蛋白的编码基因并进行序列分析.方法：根据基因数据库资料设计合成引物,以成鸡法氏囊组织中提取的DNA作模板，通过PCR获得了特异扩增产物,将其插入到pGEMTeasy载体并转染感受态E.coliDH5α菌株,提取质粒经限制性内切酶酶切鉴定后，使用DNA测序仪测定插入片段的DNA序列.使用DNAsis分析软件分析所克隆的DNA序列及其编码蛋白质，并与数据库中Apopti

2、n蛋白的编码基因相比较.结果：序列分析表明，成功地克隆了鸡贫血病毒的Apoptin基因，同基因数据库中的相关资料比较发现与山东报道的Apoptin基因（GenBankAY171617）的核酸序列一致，同鸡贫血病毒全基因序列中的Apoptin序列（GenBankAF313470）有6个核酸差异.结论：Apoptin编码基因的克隆为特异诱导肿瘤细胞凋亡治疗肿瘤奠定了基础.【关键词】鸡贫血病毒凋亡素克隆测序0引言鸡贫血病毒(chickenanemiavirus,CAV)是由DanenVanOorschot等［1］在1979年发现并能引起雏鸡贫血

3、死亡的一种环状病毒.CAV基因组长度约2.3kb［2］,能分别编码VP1,VP2和VP3三种蛋白质.其中VP3蛋白是功能蛋白质,由121个氨基酸组成.freelg冷冻组织，在1mL的匀浆缓冲液（50mmol/LTrisHCl,.freelmol/LNaCl,2mmol/LEDTA,pH8.0）中制备组织匀浆；取500μL匀浆加入SDS和蛋白酶K，使其终浓度分别为1和200mg/L，37℃温育120min消化组织蛋白，消化后加入等体积的酚和氯仿/异戊醇各抽提一次，收集上清液加入RNase，37℃温育60min，再次用酚和氯仿/异戊醇各抽提，

4、加入二倍无水乙醇沉淀，收集沉淀使用700mL/L乙醇洗涤后干燥，使用100μLTE缓冲液溶解备用.1.2.2引物的设计根据GenBank发表的CAV基因序列设计扩增引物.正向引物5′CGGCCGGCGTGGGATGAACGATCTCCAAGAAGATAC3′,反向引物5′CAAGCTTCAGTCTTATACGCCTTCTTGCGGTTC3′.粗斜体表示在正向引物和反向引物的5′端加入的NaeI和HindIII酶切位点，在正向引物和反向引物中分别加入了CG和C保护碱基.为了作Apoptin同相关蛋白的融合表达在反向引物3′端删除了终止

5、子.1.2.3PCR反应将上述目的基因进行PCR扩增，反应参数为：94℃5min预变性,94℃60s,60℃60s,72℃90s,循环30次后,72℃延长5min；PCR产物的鉴定与回收及同线性载体pGEMT连接、受体菌的转化按常规分子生物学方法进行.1.2.4阳性重组子的筛选与鉴定转化菌涂在含氨苄青霉素的加入Xgal和IPGT的LB平板上，挑取白色菌落，扩增后提取质粒，EcoRI酶切后，琼脂糖凝胶电泳.1.2.5序列比较分析选取阳性重组克隆，由上海基康公司帮助测定插入片段序列.插入片段同CAVApoptin基因序列的一致性和编码蛋白质的

6、分析使用DNAsis2.5软件完成.2结果2.1PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增产物(366bp)与目的片断相吻合（图1）.2.2重组质粒pGEMT/Apoptin的酶切鉴定重组质粒pGEMT/Apoptin经EcoRⅠ酶切琼脂糖凝胶电泳得到2659bp和约400bp(393bp)的两片段,后者与目的片断大小一致(图2).2.3重组pGEMT/Apoptin质粒中的Apoptin基因测序对获得的重组质粒进行DNA序列测定，测定的结果表明插入片段与设计片段序列完全一致，无碱基突变和读码框移位.2.4克隆Apoptin编码基因分析

7、同GenBankAF313470比较，本研究克隆的CAVApoptin基因序列有6个核酸变异；同文献报道的Apoptin基因序列AY171617一致.3讨论Apoptin是CAV的VP3蛋白基因编码的一种蛋白质，这种蛋白能特异性地诱导肿瘤细胞和转化细胞调亡，因此人们也称其为凋亡素-Apoptin,其发生作用不依赖p53基因，也不能被Bcl2过表达所抑制，有可能成为研究肿瘤细胞凋亡和抗肿瘤药物很有用的一个靶分子.为了证实克隆的基因是否为Apoptin基因,将其与GenBank数据库中相关基因进行比较,发现与GenBank数据库中登录的46株

8、CAV的VP3基因的同源性至少为98%，证实了克隆的DNA片段确为Apoptin基因.同时将克隆的VP3基因ORF推导得到的蛋白质一级结构与GenBank数据库中相关蛋白质进行比