人乳头瘤病毒16型主要衣壳蛋白l1基因的克隆和序列分析

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1、人乳头瘤病毒16型主要衣壳蛋白L1基因的克隆和序列分析摘要:目的从已感染人乳头瘤病毒（HPV）的新鲜宫颈癌组织中获得HPV16型晚期表达基因L1，为HPV感染的检测和治疗奠定基础.方法根据引物设计原则设计一对特异引物，并用PCR方法从宫颈癌组织中获得L1基因，用pGEM-T作为克隆载体，构建重组质粒并以双脱氧法双向测定插入片段序列，拼接出L1基因序列，自动测序验证并分析序列.结果从西安地区1例宫颈癌临床标本克隆到的1株HPV16型L1蛋白编码序列经BLAST2.0分析与既往报道序列存在高度同源性.结论构建

2、的重组质粒为进一步研究L1蛋白的表达及其免疫学创造了条件.　　Keyan;L1gene;cloning;humanpapillo-mavirus;cervicalcarcinoma　　Abstract:AIMToobtaintheL1majorcapsidproteingeneofhumanpapillomavirustype16fortheexploringoftheclin-icalanalysisandtreatmentofHPV.METHODSL1geneplifiedfromhumancervi

3、calcarcinomabyRT-PCR.TheproductofPCRE.coliJM-109.FolloesinedbyanautomatedDNAsequencer.RESULTSThesequenceoftheclonedL1genefromthishu-mancervicalcarcinomamuneactivity.　　0引言　　人乳头病毒（humanpapillomavirus，HPV）为无囊膜小DNA病毒，它与多种良、恶性肿瘤的发生相关［1，2］，其中HPV16型是广泛存在于我国妇女宫颈癌

4、的主要型别［3-5］.HPV基因为双链闭环DNA分子，编码10个开放读框，所有的开放读框均由一条DNA链编码，且几个基因的读框有部分重叠，晚期编码区的基因分别是L1和L2，而L1蛋白结构比较保守，在其N端含较多抗原表位，是病毒的主要衣壳蛋白和HPV的重要抗原［6］，能刺激机体产生保护性抗体.因为病毒很难在体外大量培养，妨碍了对病毒自然感染和装配的研究，所以对L1基因的克隆在进行HPV感染宫颈癌的预防和治疗方面具有深远的意义.　　1材料和方法　　1.1材料宫颈癌组织标本采自第四军医大学西京医院妇产科1例未经

5、任何治疗的手术患者（女性，46岁），手术切除后经临床病理诊断确诊为宫颈癌.标本取回后立即冻存于-20℃.载体pGEM-T，E.coliJM109由本所保存，质粒提取试剂盒（iniprepsDNAPurificationSyetem）购自美国Promega公司，限制性内切酶EcoRⅠ，SalⅠ，TaqDNA聚合酶、T4DNA连接酶、DNAmarker（DL2000）、异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）和5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal）、dNTP混合物购自大连宝生物公司，电泳凝胶

6、片段回收试剂盒购自北京宝泰克生物科技有限责任公司.　　1.2方法宫颈癌组织DNA的提取按Cotter［12］的方法，取黄豆大小的组织块，加入20mmolL-1pH8.0TE匀浆，并加入EDTA，SDS，蛋白酶K和RNase中，于37℃水浴保温过夜.用等体积的酚氯仿异戊醇（25241）抽提及0.6倍体积的异丙醇沉淀DNA，再用700mLL-1乙醇洗涤沉淀，自然风干，用100μL水溶解沉淀，稀释5倍作为模板.根据Seedorf等［13］报道，L1基因全长1596bp（5559～7154），经限制性酶切分析结果

7、（.firstmarket.cut-ter/cut2.htm）发现在6818处存在EcoRⅠ酶切位点.根据文献报道和引物设计原则，我们自行设计了从起始点至6818处的一对引物，为了便于克隆测序和表达，在引物的5’末端和3’末端分别引入了EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点.并在3’端引入额外终止码TAG.引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，引物1（5’-CGGAATTCCAATTATTGCTGAT-GCAGGTGAC-3’）和引物2（5’-CGCGTCGACC-TACATAGAATGTATGTATGTC-

8、3’）.该引物扩增的靶序列为1256bp.将提取的DNA作为模板，加入特异引物，扩增靶片段DNA.PCR扩增条件:dNTP2.5mmolL-1，引物各50μmolL-1，MgCl225mmolL-1Taq酶2.5U，加H2O至25μL.扩增参数设定为:94℃5min变性后进行35个循环，94℃1min，52℃1min，72℃1.5min，末次循环后延伸10min.将经琼脂糖电泳后回收的PCR产物与克隆载体pGEM-T与T4DN