马铃薯y病毒(山东分离物)外壳蛋白基因克隆和序列分析1

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马铃薯Y病毒（山东分离物）外壳蛋白基因克隆和序列分析王秀芳1,2温孚江1竺小平1郭兴启1（1.山东农业大学植物保护学院，山东泰安，271018）(2.中国烟草总公司青州烟草研究所，山东青州，262500)摘要以马铃薯Y病毒山东分离物（PVY-SD）基因组RNA为模板，应用RT-PCR方法和特异引物合成了外壳蛋白基因。PCR产物经kpnⅠ和BamHⅠ酶切后克隆入pUC19转化大肠杆菌DH5α，经限制性酶酶切鉴定，重组克隆中含有与PCR产物大小相同的0.8kb的插入片段，cDNA全序列分析表明，PVY-SDCP基因核苷酸序列与N株系的同源性为96%，与GENEBNAK中登录序列号为AJ390306的株系为O的同源性最高，达99%，亲缘关系最大。与国内不同学者报道的PVY中国流行株的同源性分别为96%，97%，98%。关键词:马铃薯Y病毒外壳蛋白克隆序列分析中图分类号:S432.4文献标示码:CLONINGANDSEQUENCINGOFTHEGENEENCODINGCOATPROTEINOFPOTATOVIRUSYINSHANDONGWang-xiufang1,2Wen-fujiang1Zhu-xiaoping1Guo-xingqi1(1,collegeofplantprotectionofshandongagricultureuniversity,tai’an,271018)(2,QingzhouTobaccoInstituteofChinaNationalTobaccoCorporation,Qingzhou,262500)ABSTRACT:UsingtheRNAgenomeofPVY-SDandapairofprimersspecifictoPVY,RT-PCRwasperformed,aspecificfragmentof0.8kbcorrespondinginsizetothePVYcoatproteingenewasamplified.TheproductsofPCRwereclonedinpUC19inDH5α.Therecombinantclonewasidentifiedbyrestrictionmappingandthenucleotidesequencing.ThehomologiescDNAsequencebetweenPVY-SDCPandPVYNis96%,theencodingsequencehadthehighesthomology(99%)tothatofPVYOwhoseregistrationnumberinGENEBANKisAJ390306,andthehomologiesofcDNAsequencebetweenPVY-SDCPandPVYhappenedinchinawhichdifferentauthorreportedwere96%,97%,98%.KEYWORDS:potatovirusY;coatprotein;clone;sequencing马铃薯Y病毒（potatovirusY,PVY）是马铃薯Y病毒组的典型成员，其病毒粒体呈弯曲线状，含有大约10kb的单链正义RNA，只包含一个开放的阅读框架，该病毒的外壳蛋白基因位于3’非编码区的上游[1]。PVY主要危害马铃薯，烟草，番茄，辣椒等作物，造成严重的经济损失，因而选育抗PVY感染的作物品种具有重要意义。近几年发展起来的基因工程育种为培育作物的抗病毒新品种提供了新的途径。为了掌握山东省马铃薯Y病毒株系情况，我们获得了马铃薯Y病毒山东分离物（PVY-SD），并在此基础上对其外壳蛋白基因进行了克隆和序列分析，试图为培育山东省抗PVY的工程植株打下基础。1材料与方法1．1材料马铃薯Y病毒山东分离物（PVY-SD）分离自山东省泰安市下港区感病的马铃薯上。AMV反转录酶，PCR试剂，限制酶系统，T4DNA连接酶购自宝生物工程（大连）有限公司。大肠杆菌DH5α，克隆载体pUC19由本实验室提供。1．2病毒RNA的提取从感染病毒（PVY-SD）3-4周的烟草病叶（N.tobacum,cv,samsun）中按文献［２］的方法提取病毒粒体．蛋白酶K裂解法经苯酚／氯仿萃取病毒，乙醇沉淀得到病毒RNA。作者简介：王秀芳，女（1976-），硕士，联系地址：中国农业科学院烟草研究所,262500 1.3RT-PCR扩增CP基因依据已发表的PVY核苷酸序列[3]，设计并合成了PVY外壳蛋白基因的寡核苷酸引物，上游端引物为：5’-GCGCGGATCCGCAAATGACACAATGGCATGCAG-3’下游端引物为：5’-GCGCGGTACCTCACATGTTCTTGACTCCAAGT-3’为了便于以后的遗传操作，在上游端引物中引入了BamHⅠ酶切位点（划底线部分），在下游引物中引入了kpnⅠ酶切位点（划底线部分）。以所提病毒RNA为模板，RT-PCR扩增了CP基因的cDNA，PCR反应条件为：94℃预变性5分钟，94℃变性1分钟，55℃退火1分钟，72℃延伸1.5分钟，72℃合成10分钟，扩增30个循环。１.４　cDNA的克隆及重组子的酶切鉴定扩增的PVY-SDCPcDNA目的片段和克隆载体pUC19经kpnⅠ和BamHⅠ双酶切，经T4DNA连接酶连接后，转化大肠杆菌DH5α，经选择性培养基筛选后，碱法大量提取质粒，电泳和酶切鉴定外源目的片段的插入情况。１.５　序列测定和序列分析测序工作由宝生物工程（大连）有限公司完成。DNA序列用软件DNASIS,DNACLUB结合人工对准排序进行同源性比较。应用DNAMAN软件以邻接法构建系统树，其中用于构建系统树的PVYCP基因cDNA序列部分引自GENEBANK，登录序列号分别为：AJ390306;AJ390305;Z70238;U09509;AJ3902AJ390302;AJ390308;AJ390307;AJ303093;M95491;AJ390295;Z70237;AJ255660;AJ39028;其他编号为ZHOUXRONG;PVYO;PVYN;GUOXIQI;CHURUIYIN;WZHENDONG引自文献,PVY-SD为所测定的PVY山东分离物的CP基因的cDNA核苷酸序列。2.结果与分析2．1CP基因的合成及PCR扩增以苯酚／氯仿萃取提纯的PVY病毒粒体，乙醇沉淀得到病毒RNA，以RNA为模板合成了其双链cDNA，再应用特异性的引物进行PCR扩增，扩增产物在1%的琼脂糖凝胶电泳中呈现一条分子量约为804bp的条带，没有其他非特异性DNA条带（图1）。其大小与已报道的PVYCP基因分子量相同，说明此条带即为PVY-SDCP基因的扩增产物。图1RT-PCR产物电泳图Fig.1TheelectrophoresispatternofPCRproductsLane1:DNA分子量标准（2.0kb）DNA–Marker（2.0kb）Lane2：RT-PCR产物theproductsofRT-PCRLane3：阴性对照thenegativecontrolLane4：阳性对照thepositivecontrol20001000750500250100图2重组克隆的酶切图谱Fig.2TheelectrophoresisendonucleasemapofrecombinantsLane1：DNA分子量标准（1.5kb）DNA-Marker（15kb）Lane2-3：未酶切质粒theundigestedplasmidLane4-5；经kpnⅠ和BamHⅠ酶切的质粒theundigestedplasmidbykpnⅠ和BamHⅠLane6：DNA分子量标准（2.0kb）DNA-Marker（2.0kb）20001000750500250100bp1234123456bp 2.2重组质粒的酶切鉴定经PCR扩增的CP基因克隆于pUC19后，转化大肠杆菌DH5α后，所获得的部分克隆经碱法提取质粒后，用kpnⅠ和BamHⅠ酶切鉴定，并以未酶切质粒作为对照（图2）。结果表明，重组克隆质粒经酶切后得到一约804bp的条带，说明PVY-SDCP基因cDNA片段已插入到克隆载体的正确位点。2.3PVY-SDCP基因的核苷酸序列测定和序列分析测序工作由宝生物工程（大连）有限公司完成，测序使用Fprimer和Rprimer，在ABIPROAMTM377×LDNAsequencer上完成，共分2个反应，两端测序，每个反应500个碱基，所得的cDNA及编码的氨基酸序列如表1所示，从测序结果来看，测序两端含有与引物碱基互补的序列，且含有引物设计时所加的酶切位点，两酶切位点之间的碱基数为804bp，与报道的PVYCP基因碱基数一致，表明所克隆的基因为PVYCP基因。Size804,Select11GCAAATGACACAATGCATGCAGGAGGAAGCAGCAAGAAAGATGCAAGACCAGAGCAAGGC601ANDTMHAGGSSKKDARPEQG2061AGCATCCAGTCAAACCCGAACAAAGGAAAAGATAAGGATGTGAATGCTGGTACATCTGGG12021SIQSNPNKGKDKDVNAGTSG40121ACACATACTGTGCCGAGAATCAAGGCTATCACGTCCAAAATGAGAATGCCCAAAAGCAAG18041THTVPRIKAITSKMRMPKSK60181GGAGCAACCGTGCTAAACTTAGAACACTTGCTTGAGTATGCTCCACAACAAATTGATATT24061GATVLNLEHLLEYAPQQIDI80241TCAAATACTCGGGCAACTCAATCACAGTTTGATACGTGGTATGAGGCAGTGCGGATGGCA30081SNTRATQSQFDTWYEAVRMA100301TACGACATAGGAGAAACTGAGATGCCAACTGTGATGAATGGGCTTATGGTTTGGTGCATT360101YDIGETEMPTVMNGLMVWCI120361GAAAATGGAACCTCGCCAAATGTCAACGGAGTTTGGGTTATGATGGATGGGAATGAACAA420121ENGTSPNVNGVWVMMDGNEQ140421GTCGAATACCCGTTGAAACCAATCGTTGAGAATGCAAAACCAACCCTTAGGCAAATCATG480141VEYPLKPIVENAKPTLRQIM160481GCACATTTCTCAGATGTTGCAGAAGCGTATATAGAAATGCGCAACAAAAAGGAACCATAT540161AHFSDVAEAYIEMRNKKEPY180541ATGCCACGATATGGTTTAATTCGAAATCTGCGGGATGTGGGTTTAGCGCGTTATGCCTTT600181MPRYGLIRNLRDVGLARYAF200601GACTTTTATGAGGTCACATCACGAACACCAGTGAGGGCTAGGGAAGCGCACATTCAAATG660201DFYEVTSRTPVRAREAHIQM220661AAGGCCGCAGCATTGAAATCAGCCCAACCTCGACTTTTCGGGTTGGACGGTGGCATCAGT720221KAAALKSAQPRLFGLDGGIS240721ACACAAGAGGAGAACACAGAGAGGCACACCACCGAGGATGTCTCTCCAAGTATGCATACT780241TQEENTERHTTEDVSPSMHT260781CTACTTGGAGTCAAGAACATGTGA804261LLGVKNM*268表1PVY-SDCP基因的和核苷酸序列及其编码的氨基酸Table1TheNucleotideanddeducedaminoacidsequenceofPVY-SDCPgene对PVY-SDCP基因和核苷酸序列与已报道的PVYCP基因核苷酸序列同源性比较表明，他们之间的同源性介于88-99%之间, 与登录序列号为AJ390306的同源性最高，达99%，与文献[3]的同源性为96%，而与国内不同学者报道的中国流行株的同源性分别为96%，97%，98%[4,5,6]。从株系间亲缘关系大小的角度分析，由选取的21个序列绘制的系统树的分析可知（见图3），PVY-SD与GENEBANK中登录号为AJ390306的株系为O的分离物的亲缘关系最近，它们共具一共祖节点，而与国内报道的PVY流行株系如CHURUIYIN，WZHENGDONG，ZHOUXRONG的亲缘关系较远。图3PVY系统树的绘制Fig.3PhylogenetictreeofPVYconstructed 3　讨论RT-PCR是一种常用的检测病毒的方法，大多数学者应用RT-PCR检测时一般应用常规的步骤，即先从提纯的病毒粒体中提取病毒RNA进行PCR扩增，本试验室尝试将RT-PCR与免疫学原理相结合，即利用抗原与抗体结合的特性，应用特异性引物，直接通过病叶汁液进行RT-PCR检测病毒，并获得成功。此方法省时，省力，可以快速高效的检测病毒。病毒同自然界的其他生物一样在不断的发生变异，经过自然选择，物种呈现进化的趋势。随着DNA测序技术的快速提高，DNA序列分析已成为病毒演化研究中最重要的工具之一，构建系统发生树从而明确各株系的亲缘关系及演化趋势是研究系统发育的最终目的。然而对于PVY的系统发生树的研究未见报道。为此，我们选取21个序列利用DNAMAN软件进行了系统树的构建，更加清晰的描绘出PVY系统进化的发展情况。从演化趋势来看，本试验室分离纯化的马铃薯Y病毒山东分离物是较晚才从PVY系统中分离进化来的，属于较年轻的PVY分支。参考文献[1]JoseLuisRiechmann,SiniaLain,JuanAntonioGarcia.Highlightsandprospectsofpotyvirusmolecularbiology[J].J.Gen.Virol,1992,73:1-16.[2]郭兴启，吕士恩，朱汉城等，烟草上马铃薯Y病毒的提纯与检测[J].中国烟草科学，1999，2：5-7.[3]RobagliaC,etal.NucleotidesequenceofpotatovirusY(Nstrain)genomicRNA[J].J.Gen.Virol,1989,70:935-947.[4]周雪荣，方荣祥，王成球等,马铃薯Y病毒基因组3’端区域的克隆和序列分析[J].中国科学（B辑），1991，11：1173-1179.[5]王振东，Tats’’jiHataya，张敏等，马铃薯Y病毒普通株系外壳蛋白基因的克隆和原核表达载体的构建[J].农业生物技术学报,1998,6(4):371-374.[6]储瑞银，郭涛，潘乃燧等，马铃薯Y病毒外壳蛋白基因的克隆及序列分析[J].植物学报，1991，34（3）：191-196.