甘蔗内生固氮菌klebsiella variicola dx120e固氮酶基因的克隆和功能分析

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3、ｏ／ａＤＸ１２０Ｅ固氮酶基因的克隆和功能分析张瑕瑶学科专业植物学指导教师邢永秀副教授论文答辩日期２０１５－０５－２３学位授予日期２０１５－０６－２９答辩委员会主席李杨瑞教授广西大学学位论文原创性和使用授权声明本人声明所呈交的论文，是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除已特别加标注和致谢的地方外，论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写的研巧成果，也不包含本人或他人为获得广西大学或其它单位的学位而使用过的材料一。与我同工作的同事对本论文的研巧王作所做的贡献均已在论文中作了明确说明。本人在导师指导下所完成的学

4、位论文及相关的职务作品，知识产权归属广西大学。本人授权广西大学拥有学位论文的部分使用权，目Ｐ；学校有权保存并向国家有关部口或机构送交学位论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可＾＾＾采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。本学位论文属于：□保密，在年解密后适用授权。回不保密。＂＂（请在Ｗ上相应方框内打Ｖ）论文作者签名：＾矣碱觀日期：节咬指导教师签名日期：＞也ｔ、口／作者联系电话；电子邮箱：’甘薦内生固氮菌近ｆｅＡｗｃ航ｆｖｗ撤０／＜ｉＤＸ１２ＯＥ固氣

5、巧基因的克隆和功能分析摘要一量内生固氮菌已有较甘藤为主要的糖料和能源作物之，从甘庶体内分离获得大’故多报道。贷诚ｓｚｅ舶胃０伯ＤＸ１２０Ｅ是本实验室从广西大新县种植的甘藏品种新台糖一２２号（ＲＯＣ２２）根内分离得到的株具有高固氮活性的革兰氏阴性细菌，该菌可在甘薦体内的定殖，接种ＤＸ１２０Ｅ对不同甘庶晶种具有明显的促生效应，但关于思诚始航Ｖ。州ｃｏ／幻ＤＸ１２祀固氮酶分子方面的研究述尚未见报道。本研巧对在固氮过程中起重＇要作用的固氮酶基因（喊Ｋ喊Ｄ，ｎ骑：）进行克隆及表达分析ｉ同时检测了ＤＸ１２０Ｅ一Ｘ的月卿基因在ＲＯＣ２２组培苗中的表达，为进

6、步研巧Ｄ１２犯与甘庶的互作奠定基础。主要研究结果如下：１ＤＸ１２祀固：）．设计克隆氮酶（喊Ｋ喊Ｄ基因的時异性引物，Ｗ仿如ａ，ｎ游／）ｖａｎＹｃｏ／ａＤＸ１２０Ｅ为模板，《，ＰＣＲ扩増得到含有酶切位点的《诉诉和《骑：基因的■ＯＲＦｎ）。结果表明ｗ８８２ｂＧｅ地ａｎｋ登陆号为ＫＦ７３２６４６基因，卿基因ＯＲＦ为ｐ，；游ＯＲＦ为１４５２ｂｐ，ＧｅｎＢａｎｋ登陆号为邸７３２６４８；ｎ狗：甚因ＯＲＦ为１５６３ｂｐ，ＧｅｎＢａｎｋ登陆号为ＫＦ７３２６４７。Ｈ个基因功能区域保守性均很高。进化树分析表明三个基因的’ｅ侃一贷ｅｆｃｚｉＳ氨基酸序列

7、均与ｐ．聚于同进化分支。－－ｎ２）ＥＴｎｉｆＨＥＴｉｆＤ．本研究成功构建了０巧／，ｎ游和Ｍ骑：基因的原核表达载体ｐ，ｐ°ＥＴ－ｎ和ｐｉ化。在２８Ｃ条件下，用１．０ｍｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ诱导的ｍ／Ｄ和《解基因均可表达；一ｎ与预期大小１１１巧，ｉｆＫ蛋白＾＾可溶性蛋白致的融合蛋白，蛋白＾包涵体形式存在（存在，经质谱检测鉴定为ｎｉ近和ｎｉｆＫ蛋白，为今后深入研究两个基因的功能及抗体的制备奠定了基础。■ｅｅＡＳ０－３．采用Ｗｓｔｒｎｂｌｏｔ技术，用