茶树cbf基因克隆和功能分析

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摘要低温胁迫严重影响着植物的生长发育。为了抵御低温的危害，植物在长期进化过程中形成了一套适应和抗寒机制，随着分子生物学和基因工程技术：佝发展，许多冷诱导基因在不同的植物被分离出来，植物抗寒机制的研究也更加深入。CBF是一类与低温胁迫相关的转录因子，它能够与COR基因启动予中的CRT／DRE元件特异地结合，激活COR基因的表达，提高植物的抗寒性。因此，CBF类转录因子能够综合地改良植物的抗寒性状，是目自i『比较理想的植物抗逆工程基因。茶树是一种喜温暖气候的木本常绿植物，冻害不但严重影响茶叶的产量和质量，同时也制约着茶树的地理分徊。我们一直致力于茶树抗寒研究，通过差减杂交分析，我们在茶树叶片中鉴定了10个受低温诱导的cDNA克隆片段(Cs．CORs)，本研究根据这些EST序列设计序列特异引物，通过RACE技术分离了茶树CBF类似基因的全长eDNA序列，GenBank登录号为EU563238．1，该序列包含一个长780bp的ORF，编码一个由259个氨基酸残基组成的多肽链。氨基酸序列分析表明Cs．CBF含有一个保守的AP2结合域，同时含有两段CBF特有的多肽序列PK刈RPAGRxKFxETRHP和DSAW。利用Real．timePCR技术对Cs．CB隧因进行差异表达研究，结果表明，室温条件下，茶树叶片中的cj弘基因几乎不表达，低温处理后，CJ醪飚因表达快速升高，2h后丌始下降，但在36h内仍保持较高的水平，说明o．∞琏因受低温诱导。洋葱皿细胞定位实验证明了C譬．d歼基因编码的蛋白质位于细胞核中，将Cs．CBF及各种缺失突变与GAL4DNA结合结构域融合进行酵母杂交实验，证明了Cs．CBF的C术端酸性结构域在转录激活活性中起着重要作用，且核心区域存在于C木端端部的68个氨基酸中。最后，我们成功构建了转基因烟草表达载体pBll21．CsCBF，为烟草转化实验做准备，进而研究Cs．CBF基因在植物体内的调控模式以及该基因在植物抗寒方面的作用。关键词：茶树；CBF；DRE／CRT；皿细胞定位；酵母杂交 AbstractLowtemperatureseriouslyimpairsthegrowthanddevelopmentofplants．Tocopewithsuchunfavorablegrowthcondition，higherplantshavedevelopedanumberofuniquedefensemechanismsandprocessesforacclimation．Withtheaidofcombinedmolecularandgeneticapproaches，alargenumberofgenesinducedbycoldstresshavebeenidentified，whichhelptounderstandmolecularmechanismsofcoldtoleranceinplants．CBFsaretranscriptionfactorsrelatedtoabioticstresses，theseproteinsareabletobindtheCRT／DREelementinthepromoterofcold—regulatedgenes，resultinginenhancingthecold·resistanceofplants．Therefore，itwouldbeagoodstrategytoimprovetoleranceofimportantplantstoabioticstressesbyCBFgenestransfer．CamelliaSinensisisanevergreenwoodyplantintemperateclimate，coldstressisresponsibleforreductionofteayieldasmuchasdistributionofteafield．Tounderstandthemolecularmechanismsofcoldtoleranceintea，inpreviousstudywehadidentified10partialcDNAclones(Cs·CORs)thatwererapidlyinducedbylowtemperatureintealeavesthroughtheuseofSSH．BasedontheseESTsequences，inthispaperwehaveisolatedaCBF-likegene(GenBankaccessionnumber：EU563238．1)thatcontainsanopenreadingframeencoding401aminoacids．AnalysisofthededucedaminoacidsequenceshowsCs-CBFproteincontainsaconservedAP2DNA—bindingdomainandtwosignaturesequencesofCBF：PKK／RPAGRxKFxETRHPandDSK鼬．Real．timePCRwereperformedtoidentifydifferentialexpressionofCs—CBFgeneunderdifferenttimeoftreatments，theresultsshowedthatnoCs-CBFtranscriptintealeaveswasdetectedinroomtemperature，aRercoldtreatment，thelevelofCs一(冯Fgeneexpressionwasrapidlyincreasedinashortperiodoftimeandreachedapeakat2handthendeclined．butthereremainedahigherlevelin36hours．SubcellularlocalizationofCs．CBFinonionrevealedthatCs—CBFproteinwas10calizedtothenucleus．ToinvestigatefunctionofCs—CBF,codingregionsfortheCs·CBFproteinordeletedproteinswerefusedin．frametotheyeastGAL4DNAbindingandthentransformedintoyeaststrainAH109，Cs．CBFcouldeffectivelyfunctionasatrans-activatorinyeast，moreover,theextremeC．terminalregionplaysallessentialroleintranscriptionactivation．Tofurtherstudyregulationpattemandcold-resistanceinplant，wehaveconstructedexpressionvectorpBI121-CsCBF，whichwillbeusedfortransformingtobacco．Keywords：teaplant；CBF；DRE／CRT；subcellularlocalization；yeasthybridII AmpAmpicillinCBFCORDEPCDMSOdNTPDREDREBESTIPTGKanNCBIODORFPCRRACERr-PCRSMARTSSHUTRX-gal缩略词C—repeatBindingFactorCold—regulatedgeneDiethylpyrocarbonateDimethylsulfoxideDeoxyribonucleosidetriphoshateDehydration-responsiveelementDehydration-responsiveelementbindingExpressionsequencetagIsopropylthio-p—D—galactosideKanamycinNationalcenterforbiotechnologyinformationOpticaldensity．OpenreadingframePolymerasechainreactionRapidamplificationofcDNAendsReversetranscriptionPCRSwitchmechanismatthe57EndofRNAtemplatesSuppressionsubtractivehybridizationUntranslatedregion5-bromo-4一choloro·3一indolyl-D—D—galactosideV氨：常青霉素C．repeat结合因子冷调控基因二乙基焦磷酰胺二甲亚砜脱氧三磷酸核苷酸干旱应答元件干旱应答元件结合蛋白表达序列标签异丙基硫代⋯13D半乳糖苷卡那霉素美国国立生物技术信息中心吸光值开放读码框聚合酶链式反应cDNA术端快速扩增反转录PCRRNA模板5’术端链转换机制抑制性差减杂交非编码区5．溴．4．氯．3．吲哚．B．D．半乳糖苷 信同I师范学院硕十学位论文第1章引言自然界中存在着复杂的生念环境，并不是所有的环境都有利于植物的生存，比如：干旱、高盐和极端温度等环境条件严重危害了植物的生长发育。我们把自然界中这种对植物生长不利的环境变化叫做逆境胁迫。为了应对这些不利的生长条件，植物在长期的进化过程中形成了一系列对逆境的适应和防御机制，我们把这些减缓伤害的机制称为抗逆机制。对于生活在温带和寒带的植物来说，低温是～种不可避免的胁迫，它不仅制约了植物的栽种范围，也会造成农作物的减产，是我国农林生产中重要的自然灾害之一。为了抵御低温的伤害，植物自身发展了一系列适应和抗寒机制，例如，在秋术冬初时节，植物通过感受逐渐下降的外界温度，体内发生一系列生理生化变化，产生适应性反应，从而提高对冬季低温的抵抗能力，这个过程被称作冷驯化(coldacclimation，CA)t¨。研究证明植物在经过冷驯化后比未经冷驯化时具有更强的低温耐受性，由此可知植物抗寒性并不是组成性表达而是通过低温锻炼诱导出来的。冷驯化在植物抗寒中具有重要作用，是研究植物抗寒机制的突破点，因此，关于冷驯化的机理一直是抗寒研究的热点。大量研究表明，在冷驯化过程中，植物质膜组成改变，细胞骨架发生重排，胞内渗透保护物质含量增加(可溶性糖、脯氨酸、甜菜碱等)，抗氧化剂合成水平上升(超氧化物歧化酶、过氧化物酶、抗坏血酸还原酶)等，这些变化都有助于植物在低温下生存。随着分子遗传学和基因突变技术的发展，以及拟南芥模式生物在研究中的应用，科学家提出这些生理生化变化本质上是低温下基因表达变化的结果，并克隆到了编码生理生化代诩}关键酶和低温胁迫信号传导中相关蛋白的重要基因，植物抗寒性分子机制的研究同新月异。随着对植物抗寒研究的深入和基因工程技术的迅速发展，利用转基因技术向作物中转入外源抗寒基因，已成为改良植物抗逆性的新途径。1．1植物对低温胁迫的生理应答1．1．1低温伤害植物的低温伤害可分为寒害(chillinginjury)和冻害(freezinginjury)两类，寒害是指0℃以上低温对植物的伤害，主要是指分布在热带、亚热带地区的植物。冻害 信田I师范学院硕十学位论文是指O'C以下低温对植物的伤害，主要是温带和寒带的植物。1．1．1．1寒害热带及亚热带植物或喜温植物生长发育的最低温度在O'C以上，当大气温度在lO一12℃以下时就可能遭受寒害，引起植物叶片萎蔫，光合速率下降，根系吸水能力减弱，气孔导度减小，合成能力下降，代谢混乱等等，随着寒害时『白J的增长，植物体的损伤加重，甚至引起死亡。寒害的根本原因主要是细胞质膜和细胞器膜系统受损。细胞膜是细胞接受和传递环境胁迫信号的初始部位，也是最敏感的受害部位，根据细胞膜结构功能与抗寒性的关系，Lyous,Wt2】提出“膜脂相变冷害’’学说：即当温度降低到临界温度以下，植物细胞膜的膜相首先发生改变，由原来的液晶相变为凝胶相，膜的流动性降低；冷害温度下膜收缩，膜上出现孔道或龟裂，造成膜通透性增大，导致膜内可溶性物质和电解质大量外漏，破坏细胞内外离子平衡；同时膜上结合酶活力降低，酶促反应失调，表现为呼吸作用下降，能量供应减少。他认为寒害的原初反应发生在生物膜类脂分子上，而随之出现的一系列代谢变化都是次生或伴生的，若膜脂降解，就会发生组织死亡，因此，膜脂降解是冷害不可逆的一项生理指标。同时他还推测，膜脂相变转换温度与膜中不饱和脂肪酸含量有关，含量越高，膜相变温度越低，耐寒性越强。这一推测已得到证实，目前，已经克隆出了多个脂肪酸去饱和酶，它们是不饱和脂肪酸合成的关键酶，通过降低脂肪酸的饱和度提高植物的抗寒性已取得突破性进展。1．1．1．2冻害温带和寒带的植物不可避免地要经历零度以下的低温，当温度降到零度以下，植物体内会出现结冰现象，由于细胞质中包含许多溶质，所以细胞质内的冰点低于胞外，且胞外空间存在一些细菌或灰尘作冰核，所以胞外比胞内先结冰。由于冰晶溶液要比液念溶液的水势低得多，因而胞内的水分通过质膜流到胞外，导致细胞脱水13J，并且温度越低水势差值越大，流到胞外的水分越多。因此，冻害的主要原因是细胞严重脱水，造成质膜不稳定及细胞功能异常。通过对分离的原生质体进行研究发现，冰冻引起的膜损伤的形式主要有三种：膨胀引起的裂解、片层相位到HII相位的相变和断裂突跃伤害【41，植物受损伤的形式与植物的种类及冰冻的温度都有关系。比如，当温度降低到．5℃时，在未经冷驯化的黑麦叶片原生质体中，由于冰冻引起细胞内脱水，质膜产生内吞囊状小泡，发生2 信冈I师范学院硕+学何论文内陷，从而导致质膜表面积不可逆转性的减少，一旦温度回升，溶化的水又回到细胞质中，但由于质膜表面积减少，造成原生质体在恢复到原来体积前就发!L裂解，即膨胀引起的裂解，而在冷驯化的黑麦叶片中，质膜不形成内吞小泡而璺外延状，能够使质膜完整保留下来。在更低温度下(．5℃--'lO℃)’．未经冷驯化的植物细胞脱水加剧，导致细胞膜与内膜空间距离不断缩小，最终紧密附着在一起，膜脂经历侧相分离，某些脂类聚集形成六角形对称倒置结构(hexagonalpackingsymmetry，HII)，这种结构破坏了膜双分子层，使质膜变得易透水，失去渗透效应。随着温度迸一步降低(．10℃以下)，脱水更加严重，冷驯化的原生质体也会遭受冻害，此类膜的伤害形式主要表现为断裂突跃伤害【5】，用低温冷冻电子显微镜观察，发现在质膜的冰冻断裂层发生了位置偏移，这可能是由质膜与其他各种细胞膜(特别是叶绿体膜)之间的区域性融合造成的【6】。研究表明断裂突跃伤害和HII相都是通过质膜的一种共同结构中间体形成的【71，然而，HII相结构仅出现在未经低温驯化的原生质体中，而断裂突跃伤害则出现在冷驯化的原生质体中，其中的原因目前还不清楚。1．L2植物冷驯化的生理变化植物不能像动物一样主动躲避不利环境，因此在长期进化过程中，植物对低温环境形成了一种适应机制，这种机制的作用需要低温诱导，即冷驯化。冷驯化是指植物经受非冰冻低温胁迫后，其低温抗性增强，它也是提高农作物抗寒性的有效措施之一。根据低温伤害的分类，植物冷驯化也分为寒驯化和冻驯化两类【引，前者是指喜温植物在中度低温(10—20℃)中生长一段时问能适应更低但非冰冻环境的过程，而后者是指植物经受0℃以上胁迫后，植物抵御0℃以下环境能力增强的过程。对于温带植物来说，夏季其几乎没有抗冻性，但到秋木冬初，随着气温慢慢降低，植物的抗寒性增强，这就是植物自身的冷驯化。冷驯化在农林生产中有很重要的作用，也是抗寒研究的热点，从上世纪80年代，科学家就从细胞水平及生理生化方面对植物的这种冷驯化机制进行研究，发现冷驯化过程中植物体内发生了一系列生理生化变化。1．1．2．1生物膜结构改变生物膜是细胞抵御外界不利环境的第一道屏障，膜稳定性是植物赖以生存的基础，研究表明冷驯化可以增加植物膜的稳定性。证如前面所述，膜稳定性与膜脂肪酸的不饱和度有关，在冷驯化过程中诱导产生一些酶类冷激蛋白，这类酶能使膜脂中不饱和脂肪酸的含量增加，从而降低膜脂的相变温度，维持膜的流动性。不饱和 信|；Il师范学院硕十学位论文脂肪酸的含量越高，相变温度越低，植物的抗寒能力就越划9,10]。脂肪酸去饱和酶(fattyaciddesaturase)是合成不饱矛1]一v-．肪酸的关键酶，也是冷驯化中产生的一类冷激蛋白。1993年，High等【ll】首先从一个膜脂不饱和脂肪酸突变．的蓝藻菌株中克隆了编码△12去饱和酶基因沈刚。1997年，Los等【12】发现蓝细菌在低温胁迫过程中，比鲥基因的表达水平升高，且抗寒性得到提高。此后，又从蓝细菌和高等植物中分别克隆了编码／X6、／X9以及(o．3酰基酯去饱和酶的基因desD、desC和desB[13J。研究发现，它们都有冷调节特性。磷脂酰甘油(PG)因具有较多的饱和脂肪酸，所以是决定膜脂相变温度的主要因素，其含量又取决于PG合成途径中关键酶甘油．3磷酸酰基转移酶(GPAT)的性质。1992年，Murata等114】将含低比例不饱和脂肪酸的不耐寒南瓜和含高比例不饱和脂肪酸的抗寒拟南芥中GPAT基因分别转到不抗寒的烟草中，结果显示，转入南瓜GPAT基因的烟草其不饱和脂肪酸量由转化前的64％下降至U24％，且植株不抗寒，而导入拟南芥GPAT基因的烟草不饱和脂肪酸量上升至72％，且有较强的抗寒力。1．1．2．2细胞内渗透保护物质积累冷害造成细胞内水分和可溶性物质流失，引起细胞内外离子水平失衡。在冷驯化过程中，植物会诱导产生一些具有保水作用的物质，主要包括可溶性糖、脯氨酸、甜菜碱及一些醇类物质等【15】。脯氨酸是植物抗寒研究中最受关注的一种水溶性氨基酸物质，具有较强的水合能力，还能与蛋白质相互作用增强蛋白质的水合能力1161。在冷驯化过程中，脯氨酸含量增加，维持细胞内水分，起到渗透调节作用，同时保护蛋白质胶体不致遇冷变性凝聚。提高原生质保护能力，因此，脯氨酸被看成是防冻剂或膜的稳定剂。现在已经克隆了脯氨酸合成途径的关键酶基因P5CS(--氢吡咯-5-羧酸合成酶)，将该基因转入烟草中，脯氨酸含量大大增加，其抗寒性也增强【17】。甜菜碱是一种季胺类化合物，也是常见的渗透调节物质，它一方面可作为渗透平衡物维持细胞的膨压，另一方面又可以维持低温条件下酶的活性和光系统II复合体蛋白的稳定性【18】。胆碱氧化酶(cholinemonooxygenase，CMO)能催化胆碱生成甜菜碱，在J下常条件下拟南芥不积累甜菜碱，但高表达CMO基因的拟南芥植株中积累了大量甜菜碱，并增强了对低温和赫的抵抗能力【191。此外，可溶性糖和一些醇类物质如：山梨醇，甘露醇等也是抵御低温的有效渗透调节物质。例如，在低温胁迫下，拟南芥冷驯化缺失突变体sft4r扣不积累可溶性糖12⋯，而在拟南芥抗冷组成型突变体eskl中，即使在非低温条件下，可溶性糖也积 信阿I师范学院硕十学位论文累【z¨，这就证明了可溶性糖在植物抗寒中的作用。1．1．2．3抗氧化能力提高低温下植物对02的利用率降低，过剩的02能转化成对植物有毒害作用的活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS)，同时低温下植物体清理ROS的能力下降，结果就导．致了ROS过剩，加剧膜脂过氧化和大分子蛋白质聚合，导致膜结构破坏，并最终导致植物受到伤害和死亡【221。『F常情况下，植物体内存在着清除ROS的抗氧化系统，包括抗氧化酶体系和抗氧化剂体系两类。抗氧化酶体系包括超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)、过氧化物酶(POD)和谷胱甘肽还原酶(GR)等【23，241。抗氧化剂体系主要有抗坏血酸(ASA)、类胡萝卜素、谷胱甘肽(GSH)和生育酚等【25．26,271，其中ASA和GSH是植物体内重要的还原物质，对维持生物膜结构的完整性、蛋白质结构的稳定性以及防御膜脂过氧化起重要作用。植物经冷驯化后，细胞内的抗氧化酶活性和抗氧化剂含量提高，膜脂过氧化水平降低，抗寒能力增强。氨基三哗(aminotriozole)是一种CAT专一性抑制剂，能够降低冷驯化提高玉米幼苗的抗冷效果，说明CAT在植物抗寒中有重要作用。利用基因工程技术将抗氧化酶基因转入植物体内从而增强其抗寒力也取得了一定的成功，比如，SOD能将活性氧自由基转化为过氧化氢，是植物抗氧化系统中最关键的酶。已成功将外源Fe．SOD基因转入玉米，转基因玉米内Fe．SOD活性增强，且对低温抗性明显提高12引。．。1．2植物低温应答的分子机理及研究进展1．2．1低温诱导基因的表达植物在适应低温的过程中，发生了非常复杂的生理生化变化，除了原有物质的增多或减少，还有新物质的出现，这些物质是如何产生的昵?1979年，Wreiserl29】提出了植物在低温锻炼过程中基因表达会发生改变的观点，Guy等⋯首次报道证实了菠菜在低温驯化过程中基因表达确实发生了改变。随着突变分析和分子遗传学方法的大量应用，许多低温诱导基因被发现，这些基因的表达产物主要分为两类：一类为功能蛋白，直接参与植物抗逆反应；另一类为调控蛋白，它们调节植物在逆境信号应答反应过程中的基因表达和信号转导1301。1．2．1．1功能蛋白 信刚师范学院硕十学位论文在低温诱导蛋白中，有一类蛋白具有重复的氨基酸序列和相对简单的氨基酸组成，编码该类蛋白的基因启动子中含有DRE／CRT顺式作用元件，能对低温处理作出迅速应答，这类蛋白质称为冷调节蛋白(coldregulateprotein，COR)。拟南芥的CORl5a主要由重复的13个氨基酸序列组成，富含Ala，Lys，Glu和Asp残基。corl5#基因受除受低温诱导外，还受干旱或ABA的诱导。将corl5a．)毒因转入拟南芥，发现转基因植株原生质体膜的稳定性增强，叶绿体和原生质体的抗冻性提高l℃．2℃，但是没有发现整个植株水平的抗寒性明显提高1311，表明植物的抗寒性状可能需要多个cog基因共同表达并协同作用，仅提高其中一种基因的表达不足以使植物表现出复杂的抗冻性状。胚胎发育晚期丰富蛋白(1ateembryogenesisabundantprotein，LEA)是植物种子胚胎发育晚期富集合成的一系列蛋白，这类蛋白富含甘氨酸和其它亲水氨基酸，具有高亲水性和热稳定性。干旱、低温和赫渍胁迫下也在营养组织中合成，研究发现植物的许多低温诱导蛋白是LEA蛋白。如小麦的Wesl20、COR39、Wcor410，大麦的HAVl，菠菜的CAP85，苜蓿的CASl7以及拟南芥的COR47、LTl30、RABl8等【32】。抗冻蛋白(antifreezeprotein，AFP)是最先在极地海洋鱼类中发现的一种能够阻止鱼体液中冰核形成与生长、维持体液非冰冻状态的高效抗冻活性物质。后来发现AFP蛋白存在于不同的生物体中，包括鱼类、昆虫和植物，但对鱼类抗冻蛋白的研究较多，将鱼类卯基因导入番茄，获得的转基因番茄抗冻性提高133J。有关植物抗冻蛋白的研究相对较晚，Worrall等【34】从冷诱导的胡萝卜中克隆了咖基因，并将该基因转入烟草，所获得的转基因烟草提取物能抑制冰晶生长。随后，臼廖基因再次被转入到烟草，转基因植株的抗冻性明显高于对照【35】。正如1．1．2中谈到的，植物在抵御低温的过程中，为了保持膜的完整性，维持渗透压的平衡以及减轻自由基的毒害，细胞膜的不饱和脂肪酸、渗透调节物质及抗氧化酶的含量都会发生变化，这就涉及到脂肪酸去饱和酶，催化渗透调节物质合成所需的酶及抗氧化酶基因在低温中的诱导表达，而通过对植物冷驯化过程的研究发现，编码这些酶的基因也的确受到诱导，如1．1．2所述。1．2．1．2调节蛋白调控蛋白主要参与植物在逆境信号应答反应过程中的基因表达调节和信号转导，包括蛋白激酶和转录因子等。蛋白激酶是真核细胞信号传导的重要组分，目前，已经从拟南芥中克隆了的一些受干旱、高盐和低温诱导的蛋白激酶基因，分别编码受体蛋白激酶(receptorproteinkinase．RPK)、促分裂原活化蛋白激酶6 信刚师范学院硕十学位论文(mitogen．activatedproteinkinase，MAPK)、核糖体蛋白激酶(ribosomal．proteinkinase)以及转录调控蛋白激酶(transcription．regulationproteinkinase)。植物蛋白激酶通过多重复杂的信号传导途径对干旱、高盐及低温胁迫作出反应，且不同传递途径之间存在交叉【36J!分离与植物干旱、高盐及低温耐性相关的蛋白激酶基因以及研究它们之间的相互作用，将有助于阐明植物对外界环境胁迫的分子反应和信号传递的一些关键步骤旧。’转录因子可以调控多个功能基因，因此可能在植物抵御低温的过程中有更重要的作用，目前已发现的转录因子有：bZIP、MYC、MYB、CBF等。研究最多也最清楚的一类转录因子是CBF，其作用后面将详细阐述。1．2．2低温逆境下的信号传导和基因调控途径在应答低温过程中，植物能诱导表达大量的抗寒相关基因，然而，植物细胞是如何感知外界温度变化，并将冷信号传递到细胞内，引起基因表达变化的呢?通过对冷诱导基因cot的表达以及冷信号传导的研究，发现冷驯化过程中主要存在两条信号转导途径：ABA依赖型和ABA非依赖型信号转导途径【38’39·401。1．2．2．1ABA依赖型信号转导途径脱落酸(abscisicacid，ABA)作为一种植物激素，对种子的萌发、成熟、休眠及器官脱落等起着重要作用，同时，ABA也参与植物对干旱、盐碱和低温等逆境的生理应答，因此，又称做胁迫激素。实验证明，常温下外源ABA能提高植物的抗寒性，而植物冷驯化过程中内源ABA水平升高【4¨。目前已知植物中有150多种基因可受ABA的诱导，其中包括植物组织受环境胁迫后诱导表达的基刚421。参与冷应答的ABA依赖途径的具体调控机制还不清楚，低温下ABA结合蛋白(ABA．bindingprotein，ABA．BP)活性提高，可能是感知和传递环境信号的重要环节；同时，ABA诱导6Z，尸基因表达，其编码转录因子与筚巴基因启动子区的顺式作用元件ABRE(ABA．responsiveelement)结合，调控基因表达。ABRE中的保守序列PyACGTGGC，在ABA调控的基因启动子中广泛存在【43】。目前已分离出ABl3、EmBP．1、VPl和Taf-1等多种反式作用因子，它们具有相似的结构，均含有亮氨酸拉链区域(bZip．Protein)[44】，并与ABRE核心元件结合，可能在ABA信号转导中起着重要作用。此外，一些逆境胁迫应答基因的启动子区域虽然含有ABRE序列，但该基因的表达并不受ABA所调控，而有些基因的表达虽然受ABA调控，却不含有ABRE结构。因此，在ABA依赖型的信号转导途径中，可能有多个因子参与，共同形成了 信刚师范学院硕十学位论文一个复杂的调控网络。1．2．2．2ABA非依赖型信号转导途径在ABA基因缺失突变体(ABAdeficient)或ABA敏感突变体(ABAinsensitive)中，一些基因仍然受干旱或低温诱导，这些基因包括cor78／1ti78／rd29j4，kinl，cor6．6／kin2币Icor47／rdl7等[45,46】，．这表明植物体内还存在着不依赖于ABA的信号传导途径。CBF转录因子的发现是研究冷应答ABA非依赖型信号转导途径的重大进展，它在ABA非依赖转导途径中起关键作用。1994年，Yamaguchi．Shinozaki$1Shinozakil47】在拟南芥的脱水应答基因rd29A的启动子中发现了干旱应答作用元件DRE，同时，Baker等【48】在拟南芥低温应答基因CORl5A的启动子中也发现了低温应答元件CRT，两个元件都含有核心序列CCGAC，该序列普遍存在于干旱、高盐或低温胁迫应答基因的启动子中，统称CRT／DRE元件。随后，又发现了与CRT／DRE元件结合的反式作用因子，称做CBF／DREBl，它调控启动子中含有CRT／DRE元件的COt基因的表达。目前发现的在抗冷机制中起作用的d话基因有CBFl，CBF2和CBF3。而CBF基因的表达也是受低温诱导的，G陋基因的启动子中含有一个MYCI[页式作用元件，它与另一类转录因子ICEl或ICE．1ike结合，ICEl基因在植物体中组成型表达，但ICEl蛋白结构需要冷诱导才能被激活(如磷酸化)【49】，这就构成TICEl／ICE．1ike．CBF．COR途径，是ABA非依赖转导途径的主干。．在ICEl／ICE—like．CBF．CO隧径中，还存在着许多正调控或负调控因子，它们同时又参与其它信号转导途径，构成了复杂的信号转导网络(见图1．1)。hosl基因编码RING2finger蛋白，具有泛素E3连接酶活性，催化特定的信号蛋白水解。在hosl缺失突变体中，C口硅因过量表达，说明HOSl可能是a妒基因上游的负调节因子，酵母双杂交实验证明HOSl蛋白能与ICEl相互作用，因此，HOSl可能是ICEl负调节因子，催化ICEl蛋白水解15Ⅲ。f,y2基因编码RNA聚合酶II的C端磷酸酶，通过RNA聚合酶II的去磷酸化控$1JmRNA延伸，从而调控cot基因表达。在冷环境中，拟南芥fry2突变体中的刚Icor基因表达受到强烈诱导，说明FRY2可能是∞所lcor基因的负调控因子【5¨。ZATl2基因编码一个锌指蛋白转录抑制因子，它的过表达抑制(氇F基因的表达，因此，也是e酣’基因的负调控因子【521。拟南芥中的C2H2锌指蛋I兰tAZF2和赫耐受锌指蛋白Z4rlO(STZ)基因受冷、ABA、干旱和赫胁迫的诱导，CBF3超表达的植株中别丌D的表达增强【53】，而CBF3表达缺陷的icel突变体中，彳Z刀和捌丌D的表达显著减少【49】，基因分析发现这两个基因的启动子中含有DRE、MYB和MYC 信|jI1师范学院硕十学位论文识别位剧”J，所以，CBF3可能通过DREJI顷式作用元件正调黝z砣和别丁1O(。S硒的表达。凝胶阻滞分析表明，AZF2和ZATl0(STZ)能够与EP2(负调节因子结合的顺式元件)序列特异结合，因此，对启动子中含有EP2序列的基因(LL女H：rd29a)表达起抑制作用。，D妇基因编码烯醇化酶，是生物体内新陈代谫}过程中糖酵解的成员，LOS2作用于ZATIO(STZ)基因，抑伟tJZATIO(STZ)的活性。此外，植物中RAP2．，和RAP2．6基因编码AP2类蛋白，它们也受低温诱引55】，在RAP2．J的启动子中发现了CRT／DRE元件，可能是CBF转录因子的靶基刚56l。G●懈●xp●4●·的lC州蜘an∞图1．I植物冷驯化中的调控网络【62】一．◆表，J÷町能训挖，-表乃÷激活或诱导表达，—一表爪抑制表达。Fig．1·1Schematicillustrationofregulatorynetworkinvolvedincoldacclimationinplant一◆indi。如5p055ibI。regulation；—◆indicatesactiVationorinduction。fexpression；"-"'4indicatesrepression．CBF基因的表达也受到自身产物及下游产物的反馈抑制。losI基因编码翻译延伸因子EF2，该基因突变导致蛋白质合成受阻。因此，在低温条件下，拟南芥losl9 信刚师范学院硕十学位沦文突变体中CBF蛋白合成和下游cot基因的表达都受到抑制，然而，CBF基因的转录受到强烈诱导【5¨。在拟南芥cbf2突变体中CBFl和CBF3的表达增加，在icel突变体中CBF3表达受到抑制，而CBF2表达增强，说明CBF2蛋白可能抑制CBFl和CBF3的表达，而CBF3又抑制CBF2基因的袭达【49l。在ABA非-依赖的冷调控途径中，除了CBF／DREBl转录因子调控外，可能还存在其它调节因子。拟南芥中一个功能未知的蛋I刍ESKl的突变导致耐寒能力增强，但影响的基因与CBF转录因子不同【58】。拟南芥中的hos9矛flhoslO基因都编码转录因子，参与抗冷过程【59,60】，hos9和hoslO突变体对冷胁迫敏感，但突变体中∞聪因的表达并没有发生变化，因此，HOS9军IIHOSl0在冷信号传递过程中并不依赖于CBFt”1。RNA的加工和转运可能也参与了植物的抗冷过程，肠“基因编码DEAD．boxRNA解旋酶，参与RNA从核到胞质的转运【61】，拟南芥中的核蛋白AtNUPl60(Arabidopsisnucleoporin)控制I矾A的运输，它们在植物的抗冷反应中都起着重要的作用【50】。1．2．2．3冷信号的传递在依赖ABA的信号传导中，ABAq艮,可能作为第二信使传导冷信号，而在ABA非依赖型的信号传导途径中，植物是如何传递低温信号的还不清楚。目前，比较认可的观点是Ca2+作为第二信使在冷信号的早期传递中起重要作用。低温条件下，膜的流动性和蛋白质构象发生变化，并激活质膜上的ca2+通道，胞外Ca2+进入胞内，引起胞内Ca2+浓度增加【63】。Ca2+激活磷脂酶C(phospholipaSeC，PLC)，PLC水解磷脂酰肌醇二磷酸(phosphatidylinositol一4，5-biphosphate，PIP2)，产生信号分子l，4，5一三磷酸肌醇(inositol1,4，5．trisphosphate，IP3)，IP3又介导细胞内储存的Ca：+的释放，从而上调冷驯化信号途径中a活和COt基因的表达。fryl／hos2基因编码卜肌醇多磷酸磷酸酶，参与IP3的降解，与野生型相比，痧)，，突变体中积累较多的IP3，在冷胁迫下，COt基因受到更强烈地诱导【64J。同样，hos2突变体中，FRYl蛋白的单个氨基酸被置换，冷胁迫下突变体中COt基因的表达也显著提高【651，表明IP3介导细胞内钙库Ca2+释放，调控嘶Dcor基因的表达。而随着胞内外的Ca：+流入细胞质中，MAPK信号通路通过MAP3K．MAP2K．MAPK依次磷酸化，将上游信号传递给下游应答分子【矧。IO 信圈I师范学院硕十学位论文1．3OBF的研究进展1．3．1OBF的发现及家族成员1994年，YamaguchiShinozaki和Shinozakil471从拟南芥的rd29A基因的启动子中鉴定出一个参与脱水应答的顺式作用元件DRE(d．ehydration．responsiveelement，序列为：TACCGACAT)。同年，在冷诱导基因corl5A基因的启动子中又发现了另一调控元件CRT(C．repeat，序列为：TGGCCGAC)148J。这两个元件均含有CCGAC核心序列，且普遍存在于冷诱导和脱水沥导基因的启动子中，统称CRT／DRE元件。1997年，Stockingerl67J利用酵母单杂交的方法，从拟南芥cDNA文库中克隆出一段cDNA序列，其编码产物能识另Ucor基因启动子区CRT／DRE元件并与之结合，且具有转录激活功能，命名为CBFI(CRT／DREbindingfactor1)。1998年，Gilmour等168】又从拟南芥cDNA文库中筛选获得了∞门和∞乃。在同一时间，Liu等也从拟南芥文库中分离到三个受冷诱导的cDNA，它们编码转录因子，并与DRE元件特异结合，命名为DREBlA、DREBIB和DREBl060l，后来发现它们分别对应于CBF3、CBFl和(?B砣。2002年，CBF家族的第四个成员CBF4被分离出来，和其他成员不同的是，它被干旱幂IJABA所诱导，但不被低温所诱导【_70】。在拟南芥基因组测序完成后，又克隆了CBF5；手[ICBF047n。在cj妒基因家族中，CBFl—3基因以CBFl．CBF5．CBF2的顺序『F向重复排列于拟南芥IV号染色体短臂72．8cM处，删位于CBFl下游3kb处，CBF2位于CBFl下游7kb处【68·721，而(冶尉基因位于拟南芥的第v号染色体上f70】。四个基因的阅读框内都不含内含子，CBFl，3基因紧密连锁且序列同源性高，推测3个基因可能是同一祖先基因连续重复两次后，通过突变或群体选择演变而成【68·721。对四个基因进行系统发育分析，结果显示，CBF3与CBFI亲缘关系最近，CBF4与CBFI亲缘关系最远【．701。除了模式植物拟南芥之外，还在水稻、油菜、小麦、大麦、玉米、黑麦、黑麦草等植物中也分离到类似cj弦基因。1．3．2OBF的结构CBF转录激活因子属于AP2／EREBP类转录因子，是植物所特有的一类转录因子。氨基酸序列分析显示，CBF一级结构中包含：一个N术端核定位信号区(nuclearlocalizationsignal，NLS)，控$1JCBF转录因子进入细胞核；一个C术端酸性激活区域(acidicactivationregion，AAR)，它富含酸性氨基酸，具有转录激活活性【671，还有 信刚师范学院硕+学位论文’中间一段为保守的AP2／EREBP结构域。AP2是一种植物特有的DNA结合结构域，存在于拟南芥蛋I刍APETALA2(AP2)、ANT、烟草乙烯应答元件结合蛋白EREBP以及许多其他功能未知的植物蛋白173】，由约60个氨基酸组成，在不同的植物中非常保守【55】。通过不同植物CBF氨基酸序列同源性比较发现，已知的CBFl．3蛋白中都含有两段短肽序列(PKK／RPAGRxKFxETRHP和DSAWRL)，且两段序列在进化程度不同的物种中高度同源174】。前者位于AP2DNA结合域的上游，后者在AP2DNA结合域的下游，被认为是CBF的特征序列。二级结构预测显示，拟南芥CBFI蛋白中，N术端区域$1]AP2DNA结合结构域内各含有_个a-螺旋。AP2结构域中的亲水脂a．螺旋可能是CBF蛋白的一个核心结构，参与同其它转录因子及DNA之间的相互作用，AP2结构域中还有3个D．折叠，与DNA大沟内碱基对相互作用，识别各类顺式作用元件【75】。1．3．3CBF的表达调控∞飚因的表达受低温诱导，正常生长温度下，拟南芥体内Cj盯基因的表达量很低，几乎检测不到其转录物的存在。转移到低温环境中，15min内CBFl～3基因的转录水平明显提高，l~2h内继续升高，2h后丌始下降，但在24h内仍保持较高的水平。而在ABA处理和干旱胁迫下，CBFl～3转录物不积累【63·69．721。与拟南芥中的情况一样，油菜、小麦、黑麦和番茄中类似cj盱基因的转录也在经受低温胁迫后15．30min内快速提高，几小时内达到最高，随后开始下降【741。C8聪因在叶、茎、根等器官中表达水平相似，属于非组织特异性表达【72】。对拟南芥CBFI-3基因的启动子区进行比较分析发现，它们都具有多拷贝的MYC蛋白识别序歹IJ(CANNTG)、G．box核心序YlJ(ACGT)以及在大致相同位置上的内部重复序YOACAATTANNNACAATTT[68】，这些元件可能与∞膳因的冷诱导表达有很大的关系。根据低温胁迫下∞麟录物迅速积累、∞瑚控发生在转录水平以及CBF基因启动子能介导转基因植株中G嬲报告基因的低温诱导表达等研究结果，1998年，Gilmour等提出一种模型：J下常生长温度下，植物体内存在一种无活性的CB飚因的诱导子ICE(inducerofCBFexpression)，它组成型表达，低温导致ICE构象改变使其激活，从而诱导d西基因表达。2003年，Chinnusamy等分离到了一个编码bHLH转录因子的基因，其编码产物能与CBF3基因启动子中MYC序列特异结合。且拟南芥中该基因的突变导致CBF3及其下游基因表达受抑制，将该基因命名为ICEl，但它对￡即，和C召刃的影响不大【491。通过CBF2启动子突变分析，发现CBF212 信刚师范学院硕十学位论文启动子中存在ICErl$口ICEr2结构，它们在低温诱导CBF2基因表达中其作用，证明拟南芥中可能还存在其它ICE类似蛋白【761。除ICEl外，CBF还受到其它因子的调节(见1．2．2．2)。1．3．4CBF在抗寒中的作用CBF转录因子的主要功能是与CI玎／DREJll|li式作用元件结合，激活启动子中含有CRT／DRE元件的基因表达。植物的许多冷调控和脱水诱导基因的启动子中都存在CRT／DRE元件，因此受CBF的调控。拟南芥中已知的启动子中含有CRT／DRE元件的冷诱导基因有cor6．6，corl5a、cor47，cor78，kinl年DerdlO，它们分布在整个基因组上，编码产生LAE蛋白或亲水多肽【45·77，781，在植物抗寒中起作用。拟南芥植株经受低温胁迫后15min内，C口隧因的转录水平明显提高，2h后下游基因corl5a和COl"78的转录物丌始积剥69】。同样，低温条件下，油菜、小麦和黑麦中类似a妒基因的转录物快速积累后，与拟南芥corl5a和cor78相似的冷诱导基因6以，J5和w似J『2D丌始转录1741。转基因试验更明确地证明]"CBF在植物抗寒中的重要作用。拟南芥转基因植株中C即J『和C。引町的过量表达导致cor基因在正常温度下诱导表达，或在低温胁迫下增强表达140,69,79]，而且这些基因的表达水平与a删耋因表达水平存在一定正相关【691。已经证明脯氨酸和可溶性糖具有抗寒功能，在CBF3过量表达的拟南芥转基因植株中，无论是正常温度还是低温胁迫下，尸．，舔基因(编码△．1，2二氢吡咯羧酸合成酶，是合成脯氨酸的关键酶)的表达水平都比野生型中显著提高，体内自由脯氨酸和可溶性糖含量也明显升高【401。而高水平表达CBF3转基因拟南芥植株冷处理后整株存活率达83．9％9177．9％，远远高于低水平表达植株的35．7％$148．8％169】。拟南芥转基因植株中CBF基因的过表达引起了脯氨酸、可溶性糖类以及多种蛋白的合成和积累，这些生理生化变化在植物冷驯化过程中普遍发生。由此认为，CBF转录因子就像是一个“总丌关"，多方面激活冷驯化反应的各种组成因子，从而提高植物的耐寒性【40，80】。1．4本文研究目的和意义分子生物学和基因工程技术的发展为植物抗逆性的改良提供新途径，植物抗寒性状属于复杂的数量性状，利用单一功能基因转化植物提高植物耐寒性效果并不理想，因此分离和鉴定高效的抗寒基因是限制植物抗寒基因工程的主要因素。转录因 信刚师范学院硕十学位论文子能够调控多个功能基因，因此操纵转录因子是提高植物抗逆性更有效的途径。CBF转录因子可通过调控启动子中含有CRT／DRE的冷诱导和脱水基因的表达，提高植物抗寒性，同时还可以提高植物的抗旱和耐豁能力，增强植物对多种逆境的适应能力。目前，虽然已在多种物种中发现了冷诱导转录因子，但研究的最清楚的还是拟南芥中的CBF途径及其在植物抗寒中的作用。因此，有必要对模式植物以外的植物，特别是农林作物中的CBF冷诱导途径进行系统研究。’茶树(Camelliasinensis)原产于热带和亚热带，是一种喜温暖气候的叶用植物，最适生长温度为25～30℃，气温低于10℃，茶芽停止萌发，处于休H民状态，甚至出现严重的低温霜冻。近年来，春茶频繁遭遇“霜冻’’或“倒春寒”等低温伤害，造成茶树春梢受害、严重影响产量、品质和经济效益。随着茶树种植范围的不断扩大，茶树种植区域逐渐北移以及世界气候变化异常，极端天气增多，低温已成为茶叶生产中的一个限制因素，然而目前茶树寒害分子机理还不清楚，在低温环境中，茶树中的基因表达水平如何变化，拟南芥中的抗寒途径是否也存在与茶树中，这些问题尚未解答。我们实验室一直致力于茶树中抗逆相关基因的研究，并获得了一些成果。在茶树抗寒基因研究方面，我们利用抑制差减杂交方法鉴定了10个茶树中受低温诱导cDNA片段，并构建了SMARTeDNA文库，分离这些冷诱导基因。本试验从SMARTcDNA文库克隆并分离出其中一个编号为CORl78的低温诱导基因，利用生物信息学手段对该基因及其编码的蛋白质进行结构分析和功能预测，可能编码CBF类转录因子基因；通过洋葱亚细胞实验和酵母双杂交实验分析该基因编码产物的位置及功能；并分析该基因在不同低温处理时间下的表达特性；最后，构建烟草转化表达载体，计划通过农杆菌介导将该基因转入烟草中，研究其生理生化功能，以此来探讨茶树中CBF基因的表达特性以及CBF转录因子在提高茶树抗寒性中的作用。14 信掰I师范学院硕十学位论文第2章茶树CBF类似基因的克隆与序列分析低温是农业生产中经常发生且危害严重的逆境因素之一，植物经历一段非致死低温条件的适应后，会增强对更低温度的抵御，这称做植物的冷驯化。冷驯化是揭示植物抗寒机理的途径，从上世纪80年代，科学家就丌始对冷驯化的生理生化机制进行研究。随着分子遗传学的发展，多个冷驯化过程中涉及的冷诱导基因被发现，多条冷诱导途径被报道，模式生物拟南芥中的冷驯化机制研究最为深入，这对农林作物抗寒机制的研究起到了指示作用，目前，已经从小麦、水稻、油菜、大麦以及黑麦等多种植物中鉴定并分离到了冷诱导基因。茶树(Camelliasinensis)原产于热带和亚热带，是一种喜温暖气候的叶用植物。最适生长温度为25．30℃，气温低于10。C，茶芽停止萌发，处于越冬休眠状态，甚至出现严重的低温霜冻。我国处在温带地区，低温是茶树生产不可避免的环境因素，且随着茶树种植范围不断扩大，茶树种植区域也逐渐北移，因此，茶树的低温伤害成为目fj{『茶叶生产中面临的主要自然灾害之一，目I；{『，对茶树寒害机理的研究还很少，所以，鉴定茶树冷诱导基因，探究其抗寒途径，对理解茶树抗寒机理和培育茶树抗寒品种具有重要意义。关于茶树抗寒方面的研究，我们实验室已经报道了其中的一些研究结果，即利用抑制差减杂交技术，我们成功构建了低温诱导的茶树叶片基因差异表达的差减eDNA文库，并筛选得到了10个受冷诱导的eDNA片段【s¨，为了克隆这10个基因，以低温处理茶树叶片为材料构建了SMARTeDNA文库。通过在GenBank中进行同源搜索，发现编号为CORl78eDNA片段可能是CBF类似基因，命名为Cs．CBF，由于CBF基因在冷驯化中起着‘总开关’的作用，所以，我们对这个基因进行分离及功能鉴定。本章首先根据已获得的CORl78eDNA片段序列，设计基因特异性引物，以SMARTeDNA文库为模板，通过3’RACE和5’RACE进行3’术端和5’水端扩增，然后根据拼接获得的全长序列，在3’非翻译区和5’非翻译区设计3’和5’特异引物，克隆Cs．CBF基因全长。同时，采用荧光定量方法分析该基因在不同低温处理时长下的表达特性。 信刚师范学院硕十学位论文2．1试验材料2．1．1植物材料以两年生茶树(CamelliasinensisL．)栽培品种‘信阳大叶’为实验材料。低温处理前先在温度为23~25℃，光照12h／d条件下生长7d。然后将温度降至4"C，其它生长条件不变，分别在低温处理0，2，7，15，24和36h，取充分展丌的第四片叶用于实验分析。2．1．2菌株和质粒菌株：大肠杆菌DH5a。质粒：pMDl8T载体(购自TaKaRa公司)。2．1．3试剂和试剂盒AgaroseGelDNApurification试剂盒(购自TaKaRa公司)，质粒提取试剂盒(购自AXYGEN公司)，反转录试剂盒(购自Fermentas公司)，TaqDNA酶(购自TaKaRa公司)，SYBRGreenReal·TimePCRMasterMix(购自TOYOBO公司)，TRIzol试剂(购自Invitrogen公司)，DEPC(购自Solarbio公司)，其它常用试剂为进口分装或国产分析纯。’2．1．4溶液和培养基(1)氨苄青霉素(Amp，100mg／m1)称lgAmp，加8ml无菌ddH20溶解，定容至10ml，分装小份，一20"C保存。(2)DEPC水100mlddH20中加O．1mlDEPC，充分混匀，37℃放置12h，115℃灭菌15min。(3)X—Gal(20mg／m1)20mgX-Gal溶于1ml二甲基甲酰胺中，．20。C避光保存。(4)IPTG(200mg／m1)1gIPTG溶于4ml去离子双蒸水中，定容至5ml，过滤灭菌后．20"C保存。(5)LB培养基分别称耿胰蛋白胨10g，酵母提取物5g和NaCl10g，加入约800ml蒸馏水搅拌溶解，用5NNaOH调pH值至7．O，定容1L；121℃灭菌20min。LB固体培16 信研1师范学院硕十学位论文养基在此基础上加琼脂粉至终浓度为1～1．5％(W／V)。2．2试验方法2．2．1Cs-CBF基因末端片段及全长序列的克隆根据已获得的CORl78cDNA片段序列设计Cs．CBF基因特异性引物GPSl和GPS2。以SMARTeDNA文库为模板，GPS2和5’通用引物结合扩增Cs．CBFeDNA的5’术端，GPSl和3’通用引物结合扩增3’术端，将已知的CORl78cDNA序列与所得的5’端及3’端序列拼接得到基因全长，分别在5’非翻译区和3’非翻译区设计Fulllength-l和Fulllength．2引物，扩增基因全长。引物由TaKaRa公司合成，引物序列见表2．1。PCR反应体系：10xbuffer8“l，2．5mMdNTP6．4p,1，10“M引物各4“l，模板2Ill，TaqDNA酶1gl，力HddH20至80Ill。PCR程序：94℃2min，94℃30s，52℃30s，72℃1min，30个循环。表2-1克隆o．∞飚冈所刚的引物Table2—1PrimersusedincloningCs—CBFgene按NAgaroseGelDNApurifieatioMR齐lJ盒的使用说明回收扩增产物，将回收产物连接蛩JpMDl8T载体上，反应体系如表2·2：表2-2连接反应体系Table2-2Reactionsystemoflinkage反应成分reactioningredient体积volume(91)ddH20PCR产物pMDl8TsolutionI2l517 信冈{师范学院硕十学位论文16℃，反应过夜。2．2．2大肠杆菌DHSa感受态细胞制备及转化2．2．2．1大肠杆菌感受态细胞制备．将大肠杆菌划线接种于LB培养基平板上，37*(2过夜培养；挑取一个单菌落接种于5mlLB液体培养基中，37。C，200rpm摇床培养过夜；取1ml菌液加到100mlLB液体培养基中，28。C，170rpm，摇床培养至OD600=0．4～O．5；立即将菌液置于冰上，冰浴15min；将菌液转移到预冷的50ml离心管中，4。C，5000g离一11,10mira倒掉培养液，加入10mlO．1MCaCl2溶液，重悬沉淀，4。C，5000g离心10mira倒掉培养液，加入3ml0．1MCaCl2，悬浮沉淀，充分吹打均匀，加入1．5ml60％甘油0．1MCaCl2，充分吹打均匀；分装到1．5ml离一11,管中，每管100gl，．70。C保存。2．2．2．2重组质粒转化将lO“1连接产物(见表2．2)加到100p．1感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30mira42*(2热击90s，冰浴1～2rain；；0n8001．tlLB液体培养基，混匀，37。C，200rpm摇床培养lh；在含100gg／ml氨苄青霉素的LB固体培养基平板上均匀涂布40山X—Gal(20mg／m1)和4ulIPTG(200mg／m1)，黑暗放置半个小时；涂布菌液，37℃培养过夜，出现蓝色和白色菌落。2．2．Z3重组质粒鉴定根据蓝白斑筛选理论，随机挑取几个白色菌落，分别置于5ml的LB液体培养基(力日5gl100mg／mlAmp)中，37。C，200rpm摇床培养过夜，用质粒提取试剂盒提取质粒。以质粒为模板，用GSPl／GSP2和Fulllength一1／Fulllength一2两对引物分别进行PCR扩增。电泳检测，有扩增条带且条带大小与预测一致的质粒送至上海联众基因研究院进行测序。测序正确的质粒用于后续实验。2．2．3总RNA的提取与反转录本实验过程中所用离，11,管、枪头和超纯水分别经过氯仿和DEPC处理，并进行121℃高温灭菌；金属器械经240"C高温烘烤，确保整个实验过程中无RNAase污染。分别从4。C低温处理不同时段(0，2，7，15，24和36h)的茶树幼苗上，取约O．1g幼嫩叶片用液氮反复研磨，收集于离一II,管中；快速加入1mlTRIzol试剂，18 信圈l师范学院硕?}：学位论文并按照试剂说明书提取IⅢA，收集到的RNA用DEPC水溶解。以提取的RNA为模板，反转录合成eDNA第一链。首先取总RNA2“l，Oligo(dT)is引物1“l，加水至6pl，70。C保温10rain；冰浴2mira然后再向混合液中依次加入5×M—MLVbuffer4¨l，dNTP(10mM)0．5山，RNAaseinhibitor0．5“l，M．MLV逆转录酶O．5¨l，加水至20“l，42℃保温1h；70℃保温15min，冰上冷却；．70℃保存。’2．2．4荧光定量PCR分析分别取来自于不同样品的cDNA3pl，进行4次5倍梯度稀释(1，1：5，1：25，l：125和1：625)，每个浓度各取1pleDNA作为模板，分别用内参基因Beta．tubulin和目标基因Cs．C8聪因进行实时荧光定量PCR扩增，每个浓度作3个复管。在扩增过程中，ABIPRISM7300Real．TimePCR仪(AppliedBiosystems)自动读出Ct值，并绘制出标准曲线，PCR仪自动计算出曲线的斜率，然后根据公式E=Iol'l／slop。t-算出扩增效率。通过优化实验，使每一cDNA样品内参基因和目标基因的扩增效率趋于一致。根据优化实验的结果，对不同时长处理茶树叶片中D．CB飚因表达进行定量分析，反应体系为：lplcDNA，10plSYBRGreenReal．TimePCRMasterMix，每种引物大约5pmol，加水至20“l；每一反应设3个重复。反应条件：95℃lmin，95℃15S，53℃15S，75℃30min，共40个循环。设定程序，使扩增结束后PCR仪自动运行绘制融解曲线(95℃15s，60℃15s，95℃15s)以决定是否发生了特异性扩增。2．3结果与分析2．3．1Gs-CBF基因5’端与3’端克隆以SMARTcDNA文库为模板，利用5’通用引物和GPS2扩增Cs．CBF基因的5’木端，3’通用引物和GPSl扩增3’术端，扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2一l所示，5’RACE长度约500bp，3’RACE约2000bp。回收克隆测序表明，它们分别是所克隆基因的5’端和3’端。经BLAST同源性分析，结果显示所克隆的两个cDNA片段为Cs．CBF的两个术端序列。19 信翔I师范学院硕十学位论文2．3．2Cs-CBF基因全长eDNA序列及推导氨基酸序列分析将中11自J已知序列与两端序列拼接得到121lbp长的o．∞飚因全长序列，如图2．2所示。将序列提交至fJGenBank，获取基因登录’号EU563238．1，利用NCBI在线工具ORFFinder(http／／www．ncbi．nlm．nlh．gov／gorf／orfig．cgi)搜索发现浚序列包含一个完整的-丌放阅读框ORF，长780bp，编码一个I=tt259个氨基酸残基组成的多肽链，其核苷酸编码蛋白质理论分子量为28．199kDa，等电点pI5．15。根据已经获得的完整cDNA序列，在起始密码子附近和3’非翻译区分别设计Fulllengh．1StlFulllength．2引物，以SMARTcDNA为模板扩增得：盈J810bp长的cDNA片段，含有一个与拼接序列相同的ORF。图2．1Cs．CBFcDNA扩增结果M：DL2000DNAmarker；5’：Cs．CBF幕体I的5’RACE产物：3’：Cs．CBF躺I大I的3‘RACE产物。Fig．2-lAmplificationofCs—CBFcDNAsequenceM：DL2000DNAmarker；5’：5’RACEproductofCa—CBF：3’：3’RACEproductofCs一(留F2．3．3同源性分析经BLAST比对发现，推测的Cs'CBF氨基酸序列与拟南芥、辣椒、甘薯和橡胶树的CBF氨基酸序列相似性分别是56％、63％、61％和56％。这些序列都含有AP2结构域，且高度同源(图2．3)。Sakuma报道DREBl／CBF和ERF亚家族中的ERF／AP2结构域中有两个保守的氨基酸残基不同，在DREBl／CBF蛋白中，AP2结构域中第十四位缬氨酸和第十九位谷氨酸是保守的，而在ERF蛋白中，相应位置的 信冈f师范学院硕十学位论文保守氨基酸是丙氨酸和天冬氨酸。而Cs．CBF的AP2结构域中，第十四位和第十九位保守的氨基酸分别是缬氨酸和谷氨酸，说明Cs．CBF属于DREB／CBF亚家族。此外，推测的Cs．CBF的AP2结构域术端含有一个四氨基酸序列DSAW，它在CBF蛋白中高度保守。cs．CBF的N术端附近有一段保：)。氨基酸序列PKKRGGRKKVK，而在CBF相关蛋白中该序列的同源序列越着核定位信号的作用。Cs—CBF还有一个C未端酸性结构域，可能具有转录激活功能，这些保守结构都符合CBF转录因子的特征。latccatatatatatttcatcgacacttttgtgggtttgtcccccacaggcaaacttaaat61gtttttcgtcactccaactctcatccaaacacttgaaactatcatactgctactacacta121gcactgatactgtactagATGGATTCG^GCAAGAAAAATGTGTTTTCTCACTATTCTGATMDSKNVFSHYSD181TCACTTCCTAGTGGGTCAGGTTTCTCATCCAAAG从GTAGCGG从TGCTCATCGGCGTCASLPSGSGFSKEVAECSAS241GATAGGGGCACTGGTGCTCATCCAGCTGCAATCTGCTCTGACGACGAGCTTTTGTTGGCTDRGTGAHPAICSDELA301TCAAGGAATCCGAAGAAGAGGGGAGGGAGGAAGAAAGTA从GGAGACTCGGCACCC^GTGSRNlPKRGRKVKETRHPIVI_--___．_-__．_．-___．-_---_--________________________________________-___．_．。．___．。_____。．______________________________-．__．____-____-。．_·_-_-·．__·_--________一’。一361TACCGAGGTGTGAGGTGGAGG从CGCCCACACCTGGGTCTGCG从GTGCGCGAGCCC从TYRGVRWRNAHTWVCEVREPN42lAAGAAGTCGAGGATATGGCTCGGTACATTTCCAACAGcGGAAATGGCTGCCAGAGCTCAcKSRIWLGTFPTAEMARAH481GACGTTGCTGCCATTGCTTTGAGAAATcGGATGGCTTGTGTCAATTTTGCTGACTCGGlvrDVAIALRNRMACVNFADSV541TGGAGGCTGCCCGTTCCGGCTTCATTGGATCCCAAGGACATTCAGAAAGCAGCAGCCGAGWRLPVPASLDPKDIQKAE601GCGGCTGAAATGTTTCGGCCACCGTTGTTGGAGGAGAAG从GGATGTTCCAGGTGACGTGAEMFRPLEKDVPGDV661GCACAGCCAGAAGAGGATGCGACATTGATAAcGACTGCAACTACAACAGCAACTGAAACTAQPEDATLITATATET721GCGACTGAGACGACAATGCCGGAGAATTTGCTTTTCATGGACG^CGAGGCAATTTTCGGGATETMPENLFMDEAIFG781ATGCCGGGATTGCTTGcA从CATGGCAG从GGGTTGATGcTACCTCCTCCACCGCCTCACMPGLANMAEGLMLPH841TCTGAAGGAGGAGACTGGTACGAGGGTGATGACGOGGAACTTGGl’GACGACGTGTCACTCSEGDWYEGDAELGDVSL901TGGAGCTTCTCAATTTAAaatctgacttgttttcgctttgtatagtcagacacagatattWSFSI枣961tttaaaatctagatatttttcaaaaccttacttttaatattttgggtgcaacagctcagt102lctggggttgctgcgcgcgtggtgcgcagcactaattgttctgcattttattggatttatt2l 信Ijll师范学院硕十学何论文1081ttaggatttgattcgataatttaaattattcatattttagaaggtattaagtmaaatata114lttggtaaaaaatcacctcaatcgaatatcgttatctctttcatcaaaaaaaaaaamaaf2a120laaaaaaaaa图2．2Cs．CBF核前酸及推导的氨丛酸序列小1；部分为1F编码区，星I，表_÷终止惭码了，方框中为NLS。·驴下划线为AP2DNA结构域，双下划线为特征序列。Fig．2-2NucleotidesequenceofCs—CBFeDNAanddeducedaminoacidsequenceThelower-casecharactersindicatenoncodingregions，theasteriskindicatesthestopcodon；theboxedaminoacidsarethebasicnuclearlocalizationsignals(NLS)，singleunderlineindicatcsAP2DNA·bindingdomains，doubleunderlineindicatesthecharacteristicsequence．藿a-CB暨F!錾SSP：?：r；％'FZEYIE2"7．PFq,2C4Ff]，兰攀嚣霎攀垂Ca—C日F1bIb一0F：EBlXb—C目F1^t—CaF3’，_星{}|糜陲孳露未黝瓣睦Pp：：，￡!rr0Vp二P二K：￡0一一⋯一一p’，^Lp”：0’：：T：pEGTEG一一一一一一LEM：0^：TDH：一，^0PE三LATI：LEA=EE囊眨I·VP，pIPV最I图2．3Cs—CBF的编码产物与其他物种CBF的氨基酸比对黑色表，J：谯所有的序列中都相j川的氨基酸残皋，灰色表／J；拍：多数序列中相I卅的氨皋睃残摧；三角符0为CBF的特征序列：方框中为AP2结构域；星0为保守的氨耩陵残綦；箭头表卅÷_口J能的c末端酸性结构域。Ca：辣椒，Ib：lI，薯，Hb：橡胶树，At-拟南芥。Fig．2-3AlignmentofthepredictedaminoacidsequencesofCs—CBFandotherCBFsAminoacidsidenticalinallfiveproteinsareshadedblack,whileaminoacidresiduesthatareconservedinfourofthefivesequencesareshadedgrey．ThetwocharacteristicsequencesofCBFareindicatedbytriangle．TheboxenclosestheAP2DNA-bindingmotif．Theconservedacidresiduesaremarkedbyasterisks．Thearrowindicatesthecarboxyl—terminalacidicregion．Ca：Capsicumannuurn，Ib：Ipomoeabatatas．Hb：Heveabrasiliensis，At：drabidopsisthaliana．基于来自12个物种的14个CBF蛋白的氨基酸序列，利用DNAMAN软件采用邻位法NJ构建进化树(如图2．4)。可以看出，我们克隆得到的茶树CBF氨基酸序列首先与枸橘的CBF聚类，说明它们有较近的起源，而同为木本植物的橡胶树、节果树和，¨睇阻∞％∞强∞∞蕃未卅氘L}旷弛}¨""驰阱釜!{兰|：；燮黼；j：胛雌盹∞w”E眦Mr"x—h{M羔罢mM住吖％叫竹纠_钝“篓|!一譬塞～托肛Ⅳ肟{_：，誉￡∞￡j强：三：∞善m肛m 信同i师范学院硕十学何论文棕榈，它们的CBF与茶树有较远的起源。拟南芥中3个CBF成员首先聚类，说明CBF物种之间的差异要大于家族成员之间的差异。CBFIb[CapsicumanHuym】．CBF3"[Lycoperstconesculentum】一CBF[PoncirustrifoliataJ—CBFlCamelliasinenslsl_CBFIIArabidopststhaliana】-CBF2们rabidopsfsthalianalCBF3∽rabidopsisthalianaJ—CBF[Ravenearivularis】一CBFIDypsislutescens】一CBF【}，Ttisrtparia】一CBFIftteveabrasiliensis】CBF[Betulapendula】CBFI【Malusxdomestical图2-4CBF蛋白系统进化树分析Capsicumannuum：辣椒，Lycopersiconesculentum：番茄，Poncirustrifoliate：枸橘，Camelliasinensis：茶树。Arabidopsisthaliana：拟南芥，Ravenearivularis：椰了，Dypsislutescens：敏尾葵。Trachycarpusfortunei：棕棚，Vitisriparkz：河片葡萄，Heveabrasiliensis：橡胶树，Betulapendula：垂直件。Malus工domestica：节果树．Fig．2-4PhylogeneticTreeofCBFproteinsCapsicumannuum：hotpepper,Lycopersiconesculentum：potato．Poncirustrifoliate：atrifoliateorange，Camelliasinensis：tea,Arabidopsisthaliana：thalecress，Ravenearivularis：coconut，Dypsislutescens：yellowpalm，Trachycarpusfortunei：palm，Vitisriparia：grape，Heveabrasiliensis：rubbertree，Betulapendula：birch，Malus工domestica：apple．2．3．4Os-CBF基因表达特性分析我们从4℃低温处理24h茶树幼叶中分离到了Cs．CBF基因，并通过序列分析发现它与其它植物的CBF基因同源。模式生物拟南芥CBF基因的研究表明，CBF基因的表达受低温诱导。J下常生长温度下，拟南芥体内CBF基因的表达量很低，几乎检测不到其转录物的存在，转移到低温环境中，15min内CBFI-3基因的转录水平明显提高，l~2h内继续升高，2h后丌始下降，但在24h内仍保持较高的水平。茶树属于常绿木本植物，与拟南芥差别较大，为了了解茶树中CBF基因的表达模式，我们采用实时荧光定量PCR技术，以Beta．Tubulin为内参基因，对4℃低温 信刚师范学院硕十学位论文处理不同时间长叶片中的CBF基因进行定量分析。结果表明，在正常条件下，叶片中CBF基因几乎不表达，低温处理后，CBF表达迅速升高，2h后丌始下降，但在36h内仍保持较高的水平(图2．5)。表明茶树中CBF基因的表达模式与拟南芥CBF基因的表达模式相似，而茶树中CBF基因的表达可能更为持久，CBF基因的这种诱导模式说明该基因可能参与了茶树的抗寒应答。O7¨2l符弱图2-5低温处理不同时K．卜．Cs．CBF基冈相对表达水平变化情况Fig．2-5ChangesofCs·CBFgenerelativeexpressionlevelwithtreatmenttimeinresponsetocoldstress●2．4讨论2．4．1Cs-CBF基因的分离与克隆SSH技术是一种高效快速克隆差异新基因的技术，广泛应用于分离各种生物及非生物胁迫条件下诱导表达的抗性相关基因，从而揭示植物抗逆的分子机理。我们实验室以茶树幼叶为材料，利用SSH技术已经成功构建了低温诱导差减cDNA文库，并从中获得了10个cDNA片段，克隆测序获得了它们的序列信息，同源搜索分析发现一个编码CBF转录因子的cDNA片段Cs．CORl78，后来命名为Cs．CBF。CBF转录因子在植物应答低温中起着关键作用，这在拟南芥、油菜、烟草等一些草本植物中得到了一些相关证明，而茶树幼叶中Cs—CBF基因的分离}兑明在常绿木本植物茶树中也存在CBF冷冻反应途径。CBF作为转录因子能够调控多个功能基因，24∞街∞衢竹co一-．-‘4x．．c．口 信研1师范学院硕十学位论文因此，无论是对植物抗寒机制的研究还是对植物基因工程的发展，CBF都具有重要的作用。我们以模式生物拟南芥中CBF的研究为指导，探究茶树中CBF基因的功能，期望对茶树的抗寒分子育种提供一些理论基础。为了分离lO个冷诱导基因，我们以4。C处理24hgJ茶树幼叶为材料，利用SMARTcDNAsynthesisKit构建了SMARTcDNA文库。根据RNA3’端polyA特性设计引物，以RNA为模板合成第一链cDNA，SMARTcDNAsynthesisKit中反转录酶可以在合成的3’术端添加CCC，并转换模板合成一小段已知序列，然后以第一链为模板合成第二链，这样得到的cDNA文库中所有的cDNA都有相同的5’和3’端。克隆全长cDNA常用到的方法是RACE，根据所克隆的序列分5'-RACE和3'-RACE，通过测序我们已经获得了Cs．CORl78片段序列，根据此序列设计特异引物，并结合通用引物，采用5’．RACE和3'-RACE获得5’和3’端。在分离5’和3’端的过程中，我们遇到了一些问题，主要问题是非特异性扩增，为了克服这个问题，我们优化了PCR条件，摸索退火温度，采用高保真酶，采用两步法。为了进一步研究茶树CBF基因的结构和功能，以及对后续实验如植物表达载体构建等做基础，我们采用RT-PCR来克隆Cs．CBFcDNA全长ORF序列。2．4．2Cs-CBF基因的序列分析AP2／EREBP家族中包括与调控植物细胞周期、生长发育以及环境胁迫应答反应等相关的一系列转录因子，该家族成员的转录激活结构域差异很大，但它们都含有一个由60个氨基酸残基左右组成的相当保守的DNA结合结构域，即AP2／EREBP结合域。我们克隆到的茶树CBF基因编码的氨基酸序列和其他植物CBF转录因子一样，同样具有由约60个氨基酸残基组成的AP2／EREBP结合域，这在在进化上非常保守，且该结构域中第十四位的缬氨酸(14V)和第十九位的谷氨酸(19E)两个功能性保守氨基酸也在茶树CBF中存在。进一步分析表明，在茶树CBF基因编码的氨基酸序列中存在两段特征序列PKK／RPAGRxKFxETRHP和DSAW(图2．3)，前者位于AP2DNA结合域的上游，可能与蛋白运输有关，后者位于AP2DNA结合域的下游。Riechmann等173】分析了拟南芥中大约140种含有AP2／EREBP结构域的蛋白后发现，只有CBFl、CBF2和CBF3才具有这两段多肽序列，而这三种蛋白均与低温胁迫有关，所以称它们为CBF类蛋白的特征序列。这两段特征序列在进化程度不同的物种中保守存在，说明它们具有重要的功能。 信I；11N范学院硕十学位论文而茶树CBF编码的氨基酸序列N端和C端与其他植物中CBF基因编码的氨基酸序列差异较大。推测C端序列在CBF转录因子中可能起着转录激活的功能。CBF蛋白既具有较高的保守性区域，同时又具有较商的可变性区域，这种结构保证了CBF转承因子结合的专一性，同时也使它们具有激活功能上的多样性。2．4．3t?,s-CBF基因的表达分析．在模式生物拟南芥中，CBF基因的袭达特性研究最清楚，『F常生长温度下，拟南芥中的CBF基因的表达量很低，几乎检测不到其转录物的存在，转移到低温环境中，15min内CBFlo基因的转录水平明显提高，l一2h内继续升高，2h后丌始下降，但在24h内仍保持较高的水平。而ABA和干旱胁迫处理，CBFI-3转录物不积累【68,69,721，Oilmour等【68】发现CBF基因也受机械损伤的诱导。在其他植物像油菜、小麦、黑麦和番茄中的研究发现，类似CBF基因的转录也在经受低温胁迫后15～30min内快速提高，几小时内达到最高，随后丌始下降f741。茶树属于常绿多年生木本植物，从进化关系上与草本植物相差较远，为了研究茶树中C阡基因应答低温胁迫的响应模式，我们运用Real．timePCR技术分析了茶树幼苗在低温处理不同时长后，叶片中a玎基因的表达差异。Real．timePCR技术是一种核酸定量分析技术，它在常规PCR基础上添加荧光染料或荧光探针，监控模板DNA的扩增，与半定量RT-PCR和Northernblotting方法相比，Real．timePCR具有灵敏性高、自动化程度高、特异性和可靠性更强、实时性和准确性等特点。实时荧光定量结果显示：室温条件下，茶树叶片中的CBF基因几乎不表达，低温处理后，CBF表达快速升高，2h后丌始下降，但在36h内仍保持较高的水平(图2-5)。这种表达特性与拟南芥以及其他植物中的CBF基因相似，只是茶树中CBF基因的表达可为能更持久，说明该基因无论在结构还是功能上都很保守，可能在植物的抗性机制中起着重要作用。 信刚师范学院硕士学位论文第3章Cs．CBF的细胞定位及转录激活功能的鉴定通过生物信息学分析，我们发现Cs．CBF的N术端附近有一段保守氨基酸序列PKKRGGRKKVK，而在CBF相关蛋白中该序列的同源序列起着核定位信号的作用，因此，预测Cs．CBF基因编码的蛋白质定位在细胞核中。为了验证这一结果，我们将Cs．CBF基因的编码区与GFP基因融合，通过农杆菌介导转入洋葱表皮细胞，融合基因在洋葱细胞中瞬时表达生成融合蛋白，GFP蛋白在荧光显微镜下能够显示绿色，从而确定Cs．CBF在细胞中的位筒。此外，Cs．CBF还具有C术端酸性结构域，推测可能含有转录激活模块，为了鉴定这个结构域的作用，我们将Cs．CBF基因的编码区及各种缺失突变序列分别插入到酵母的表达载体pGBK7的GAL4DNA结合结构域编码区，然后转化导入GAL4基因缺陷的酵母菌株AHl09中，由于pGBK7载体中缺失GAL4转录激活结构域序列，因此，若CsCBF或缺失突变序列具有转录激活活性，就能与载体上的GAL4DNA结合结构域互补，在酵母菌株AHl09表达具有完整功能的GAL4转录因子，从而启动下游报告基因的表达，使菌株能够在营养缺陷型的培养基上生长。根据此方法，我们对Cs—CBF的转录激活区进行了精细定位。3．1试验材料3．1．1植物材料洋葱。3．1．2菌株和质粒菌株：大肠杆菌DH5a，农杆菌EHl05，酵母菌AHl09。质粒：pBll21表达载体(见图3一la)，pGBKT7表达载体(见图3-2b)。3．1．3试剂和试剂盒纯化试剂盒(购自AXYGEN公司)，连接试剂盒(购自TaKaRa公司)，XbaI酶(购自Fermentas公司)，EcoRI酶(购自TaKaRa公司)，PstI酶(购自TaKaRa公司)，AlkalinePhosphatase(BAP)(购自TaKaRa公司)，鲱鱼精DNA(购自Solarbio公司)，DMSO(购自Solarbio公司)，其它常用试剂为进121分装或国产分析纯。 信刚师范学院硕十学能论文图3—1pBll21(a)和lpGBKT7(b)载体信息Fig．3—1pBll21(a)andpGBKT7(b)VectorInformation3．1．4溶液(1)卡那霉素(Kan，50mg／m1)称O．5gKan，加8ml无菌ddH20溶解，定容至10ml，分装小份，一20"(2保存。(2)10xTEbuffer0．1MTris．HCI，10mMEDTA，无菌ddH20定容。(3)10xLiAe1MLiAc，用稀醋酸调PH至7．5。(4)50％PEG(W／V)，过滤除菌。(5)ZbufferNa2HP04。7H2016．1g／L，NaH2P04·7H205．5g／L，KCl0．75g／L，MgS04。7H200．246g／L，调PH至7．0，无菌ddH20定容。灭菌后室温保存一年。(6)13．毓基乙醇／Zbuffer100mlZbuffer中加O．27mlD．巯基乙醇。、(7)ONPG／Zbuffer1mlZbuffer中加4mgONPG，调PH至7．0，现配现用。(8)1MNa2C03(9)微量元素称取0．083gKI，0．62gH3804，2．23gMnS04·4H20，O．86gZnS04·7H20，0．0025gCuS04·5H20，0．0025gCOCl2·6H20，用ddH20溶解，取0．025gNa2MoO。·2H20用ddH20单独溶解，混合，定容至lL。 信同I师范学院硕十学位论文(10)Vitamin称取0．1g烟酸，0．1gVB6，0．1gVBl，0．2g甘氨酸，用ddH20溶解，定容至1L：4℃保存。(11)FeZ+-EDTA．称取2．78gFeS04·7H20，用ddH20溶解，称取NaEEDTA·2H20，用ddH20溶解，混合，70。C水浴2h，定容1L；4。C保存。(12)10x-Trp／一MetDO溶液：Ade200mgArg200mgHis200mgIle300mgLeulgLys300mgPhe500mgThr2gTyr300mgUra200mgVal1．5gAsp1g定容至1L121℃灭菌15min，4*C保存一年。10x—Trp／-His／-AdeDO溶液：Arg200mgIle300mgLeu1gLys300mgMet200mgPhe500mgThr2gTyr300mgUra200mgVal1．5g定容至1L3．1．5培养基(1)YPD培养基分别称取胰蛋白胨20g，酵母提取物10g和葡萄糖20g，加入约800ml蒸馏水搅拌溶解，pH值调至6．5，定容1L；llS"C,灭菌15min。YPD固体培养基在此基础上加琼脂粉至终浓度为1～1．5％(W／V)。(2)SD／-Trp／．Met培养基分别称取不含氨基酸的酵母氮碱6．7g，葡萄糖20g和10x-Trp／-MetDO溶液100ml，加入约700ml蒸馏水搅拌溶解，pH值调至5．8，定容1L：115。C灭菌15min。SD／-TrrI／-Met固体培养基在此基础上加琼脂粉至终浓度为2％(w～)。 信鞠1师范学院硕十学位论文(3)SD／-Trp／．His／-Ade培养基分别称不含氨基酸的酵母氮碱6．7g，葡萄糖20g和10x-Trp／-His／一AdeDO溶液100ml，加入约700ml蒸馏水搅拌溶解，pH值调至5．8，定容lL；115"C灭菌15min。SD／-Trp／-His／-Ade固体培养基在此基础上加琼脂粉至终浓度为2％(W／V)。(4)1／2MS培养基量取微量元素2．5ml，Vitamin5ml，Fe2+-EDTA5ml，称CaCl2·2H200．1lg，MgS04‘7H200．0925g，KH2POt0．0425g，KN030．48g，NHgN03O．41g，肌醇O．05g，蔗糖10g，定容500ml；固体培养基在此基础上加phytagelTM1．5g；115"C'灭菌15min。3．2试验方法3．2．1PCR扩增根据已知的C's．CBF序列，设计一对引物178．GFP．F／178．GFP．R(引物序列见表3．1)，该引物仅扩增Cs．CBF基因的编码序列(不含终止子)，并在两个引物的5’端引入XbaI酶切位点。在设计引物时应考虑构建融合基因的序列移码问题，使融合基因中CBF编码区后连接的GFP序列的读码框不会发生改变。以插入Cs．CBF。全长序列的pMDl8重组质粒为模板，扩增Cs．CBF基因的编码序列。根据已知的Cs．CBF序列，合成12个引物(引物序列见表3．1)，其中在5’端引物引入EcoRI酶切位点，在3’端引物引入PstI酶切位点序列，以插入Cs．CBF全长序列的pMDl8重组质粒为模板，扩增Cs．CBF基因编码区各种缺失片段：1-778bp(178一left1／178-fight1引物)、1-222bp(178-left1／178一right2引物)、l一408bp(178．1eft1／178．right3引物)、220．408bp(178．1eft4／178．right3引物)、220．778bp(178．1eft4／178．right1引物)、409．778bp(178．1eft6／178．rightl引物)、409．522bp(178．1eft6／178．right7引物)、409．573bp(178．1eft6／178．right8引物)、514．660bp(178-left9／178．right9引物)、574．778bp(178．1eft10／178．fightl引物)、643．778bp(178．1eft11／178．rightl引物)。PCR反应体系10xbuffer81al，dNTP(2．5mM)6．4pl，引物l(10uM)4“l，引物2(10“M)4p．1，模板1“l，TaqDNA酶lm，加ddH20至80“l。PCR条件：94℃2min，94℃30s，52℃30s，72℃lmin，30个循环。30 信m师范学院硕十学仲论文表3一l载体构建中克隆o．a妒基冈所朋的引物Table3—1PrimersusedincloningCs．CBFgeneforconstructingvectors引物编号primernumber引物序列primersequence注羊h}anll]oration178·GFP．-F5'-ggtctagaatggattcgagcaagaaa-3’’岔XbaI酶切化点的5’端引物178-GFP-R。5'-ggtctagaaattgagaagctccagag-3’含XbaI酶切位点的3’端引物GFP．-reverse5'-aagtcgtgcttcatgtg-3’．GFP基冈3’端引物178·leftl5'-gggaattcatggattcgagcaagaaa-3’含EcoRl酶切能点的5’端引物178-left45'-gggaattcgtgtaccgaggtgtgagg-3’含EcoRI酶切能点的5’端引物178-left65’-gggaattcctgcccgttccggcttcatt．-3’含EcoRJ酶切位点的5’端引物178．-left95'-gggaattcggtgacgtggcacagccag-3’含EcoRI酶切何点的5’端引物178．-left105'-gggaattcactgaaaclgcgactgag-3’含EcoRI酶切位点的5’端引物178·left15'-gggaattcatgccgggattgcttDcaa-3’含EcoRI酶切位点的5’端引物178-right15’-ggctgcagaattgagaagctccagag-3’含胎，I酶切位点的3’端引物178一right25'-ggctgcagcactgggtgccgagtctc·-3’含风fI酶切倪点的3’端引物178．·right35'-ggctgcagcctccaaaccgagtcagc．-3’含风fI酶切位点的3’端引物178-．right75'-ggctgcagcacgt,：cacctggaacatcct-3’含nfI酶切位点的3’端引物178·-right85'-ggctgcagtgctgtttgtagttgcagtcg-3’含丹，I酶切何点的3’端引物178·．right95'-ggctgcagttgcaagcaatcccggcat-3’含PstI酶切何点的3’端引物3．2．2载体构建(1)纯化按照纯化试剂盒说明纯化PCR扩增产物。(2)酶切用XbaI内切酶酶切178一GFP—F／178一GFP．R引物扩增的PCR产物和pBll21载体，反应体系如下：表3-2酶切反应体系Table3-2Reactionsystemofdigestion反应成分reactioningredient体积volumeiOXTangoTMBuffer质粒DNA或PCR产物XbaI酶ddH205“l2lag1．5“l至50山用EcoRI和PstI内切酶双酶切缺失PCR片段和pGBK7载体，按以下体系配31 信研1师范学院硕十学能论文置反应液：表3-3舣酶切反应体系Table3-3Reactionsystemofdoubledigestion反应成分reactioningredient体积volume’10XHBu能r质粒DNA或PCR产物EcoRI酶nfl酶ddH205Ⅲ2嵋1．5Ⅲ1．5“l至50p1．37"(2反应3～4h，反应结束后，电泳检测，然后用纯化试剂盒纯化。为了防止pBll21载体自连，采用去磷酸化酶对pBll21酶切载体进行去磷酸化，反应液体系如下：表3_4载体去磷酸化反应体系Table3-4Reactionsystemofdephosphorylation反应成分reactioningredient体积volume(p1)65。C水浴30min，纯化试剂盒纯化。(3)连接用连接试剂盒连接纯化的PCR酶切产物和载体酶切产物，反应液体系如下：表3-5连接反应体系Table3-5Reactionsystemofligations反应成分reactioningredient体积volume(I．d)ddH20PCR酶切产物载体酶切产物solutionI12532 信刚师范学院硕十学位论文16℃，反应过夜。(4)重组质粒鉴定将连接产物转入DH5a感受念细胞中，37℃条件下，在含有卡那霉素的LB培．养基上生长过夜，至培养基上长出单菌落。由于pBll21重组质粒为单酶切产物连接，因此可能出现载体自连，J下向连接和反向连接的情况。根据载体上GFP基因的3‘端设计引物GFP．reverse(引物序列见表3．1)，用178．GFP．F／GFP．reverse引物，以单菌落为模板，PCR扩增，然后电泳检测，与载体正确连接的扩增片段大小约为900bp，挑取阳性菌落测序鉴定。pGBK7重组质粒为定向连接，用扩增缺失片段的原有引物对单菌落进行PCR检测，阳性菌落进一步测序鉴定。测序正确的菌落进行液体培养，用质粒提取试剂盒提取重组质粒。3．2．3农杆菌感受态细胞制备及转化(1)农杆菌感受念细胞制备将农杆菌划线培养于LB培养基平板上，28℃培养1～2天；挑取一个单菌落接种于5mlLB液体培养基中，28℃，200rpm摇床培养至饱和，约36h：取2ml饱和培养液加到100mlLB液体培养基中，28℃，170rpm，摇床培养至OD600=0．5—0．8，约5h；立即将菌液置于冰上，冰浴20min；将菌液转移到预冷的50ml离心管中，4℃，10000r／min离心5min；倒掉培养液，加入10ml20mMCaCl2溶液，重悬沉淀，4℃，10000r／min离心5mini倒掉培养液，加入3ml20mMCaCl2，悬浮沉淀，充分吹打均匀；分装到1．5ml离心管中，每管100gl，．70℃保存。。’(2)重组质粒转化取5“l重组质粒加到100“l感受念细胞中，轻轻混匀，冰浴30mini．70℃冷冻5min；28℃温浴5min；加800rtlLB液体培养基，混匀，28℃，150rpm摇床培养5h；涂到含有卡那霉素(浓度50ng／m1)的LB固体培养基上，28℃培养24～48h。3．2．4洋葱表皮细胞转化挑取含有重组质粒的单菌落接种于100mlLB液体培养基(卡那霉素50ng／m1)中；28。C，200rmp，摇床培养至OD600=0．5-0．8，4000r／min离心10min，1／2MS液体培养基悬浮沉淀；按1：50的比例接种到50mlLB液体培养基(As20gmol／L)中，28。C，200rpm摇床培养过夜；5000r／min离心5min，用LB液体培养基(MgCl2 信田1师范学院硕十学位论文10mmol／L，As20I|,rnol／L)重悬沉淀。‘无菌条件下，取洋葱鳞茎，切成若干个约lcm2小块，剥取表皮细胞，无菌水浸泡，用滤纸吸干，平铺到1／2MS固体培养基上，28℃暗培养24h；用预处理的农杆菌菌液浸泡预培养的表皮细胞30rain：吸干表面菌液后，平铺到1／2MS固体培养基上，25℃培养2d，16h光照／8h黑暗。清沈共培养后的洋葱表皮细胞，置载玻片上，480nnl波长下，荧光显微镜观察。3．2．5酵母感受态细胞制备及转化(1)酵母感受念细胞制备．将酵母菌划线于YPD固体培养基上，30℃培养1．2d；挑取单菌落接种于50mlYPD液体培养基中，30℃，200rpm，摇床培养至酵母菌生长静止期，约14～16h，菌液移至新鲜YPD培养基，稀释至OD600=0．2—0．3；30℃，200rpm，摇床培养至OD600=0。4—0．6；用50ml离心管5000g离心收集菌体；1／2体积无菌水重悬，离心收集茵体；1．5ml新鲜配制的无菌100mMLiAc重悬，转至1．5ml离心管中；14000r／min离心15s，收集菌体，1．5ml100mMLiAc重悬。(2)转化取O．1嵋重组质粒与0．1mg鲱鱼精DNA混匀，加到100肛l的酵母感受念细胞中：加0．6mlPEG／LiAe，高速震荡10s；30℃，200rpm，摇床培养30min：加入70“lDMSO，轻轻颠倒混匀，42℃水浴15min，冰浴1．2min，14000r／rain离心5s收集菌体；用O．5ml无菌TE重悬，取100“l涂布于筛选培养基上，30℃培养。3．2．6酵母B一半乳糖苷酶活性测定挑取单菌落接种于5mlYPD液体培养基或SD筛选培养基(含有转化质粒)中，过夜培养，取2ml至8mlYPD培养基中，30℃，200rpm，摇床培养至OD600=0．5～0．8，记录精确OD值；3个1．5ml离心管中各加1．4ml菌液，14000r／min离心30s收集菌体；加1．4m1Zbuffer重悬细胞，离心收集菌体，加280“lZ。buffer重悬细胞(concentrationfactor=1．4／0．28=5)；取100“l悬液至新离心管中，设对照为100p1Zbuffer，液氮中冻1min，37℃水浴1min，反复冻融2次以上；加入700“1p．筑基乙醇／Zbu位r，然后加入160斗lONPG／Zbuffer，丌始计时；30℃反应，出现黄色后加400“11MNa2C03终止反应，汜反应时间：14000r／min离心10min，取上液，测OD420。34 信刚师范学院硕十学位论文p·半乳糖苷酶的活性单位为：1000×OD420OD600X测定体积×时问测定体积：O．Iml×concentration]hetor：时间：min．3．3结果和分析3．3．1Cs-CBF在细胞中的位置GFP基因的编码区与Cs．CBF基因的3’端编码区融合，构建Cs．CBF：：GFP融合表达载体(图3．2)，35S启动子驱动融合蛋白在洋葱表皮细胞中瞬时表达，通过荧光显微镜观察，确定融合蛋白在细胞中的位置。推测的Cs．CBF氨基酸序列预测含有一个ERF／AP2结构域和一段保守的NLS序歹0(PKKPAGRKKFR)，因此，推测该蛋白质定位在细胞核中。在该实验中，我们观察到，在480nnl波长的激发光下，GFP与Cs．CBF融合蛋白的绿色荧光特异性出现在细胞核中(图3．3)，而没有与Cs．CBF结合的GFP绿色荧光均一地分散在细胞质中，这说明Cs．CBF中含有细胞核定位序列，而且该序列的活性不需要翻译后修饰。PsiIXbaIXhalEcoRl图3-2Cs．CBF和GFP融合基冈的构建Fig．3-2constructionofCs—CBFandGFPgenefusion3．3．2Cs-CBF在酵母中的转录激活活性T-bordcr(1cft)Cs．CBF具有碳术端酸性结构域，可能含有转录激活模块。为了鉴定这个结构域的作用，我们将。一C四膳因编码区及各种缺失突变分别插入到表达载体pGBK7hb，与GAL4的DNA结合结构域融合，转到G■￡4基因缺失的AHl09酵母中(图3-4)。AHl09菌株中含有三个报告基因：lacZ，his，ade，它们受：至IJGAL4转录因子的调控， 信刚师范学院硕十学位论文但AHl09菌株中GAL4基因功能缺失，因此，AHl09菌株本身不能合成组氨酸，腺嘌呤，当培养基中缺少这些物质时，不能生长。pGBK7LP含有GAL4的DNA结合结构域编码区，若Cs．CBF具有转录激活活性，则它与GAL4结合结构域共同作用，启动报告基因表达，使AH]09突变酵母菌株够在缺乏组氨酸，色氨酸和腺嘌呤的筛选培养基上生长。实验表明：在GAL4不存在激活结构域的情况下，野生型fl勺Cs．CBF与GAL4DNA结合结构域融合能够有效的激活报告基因(图3．5)，而单独的GAL4DNA结合结构域不能激活报告基因表达，这说明Cs．CBF在酵母中具有转录激活功能。为了更精确的定位转录激活结构域，用同样的方法检测Cs．CBF的各种缺失突变子，图3．5A显示C术端区域的缺失(Cs．CBFAC，Cs．CBF△C1，Cs．CBFAN△C1，Cs．CBF△Nl△C2SHCs．CBFANlAC3)导致报告基因不能被激活，相反，N术端的缺失(Cs．CBFAN$[1Cs．CBFANl)不影响报告基因的表达，这一结果证实了C术端酸性结构域在Cs．CBF功能中的重要作用。而且，当把C术端端部区域与GAL4DNA结合结构域融合后(Cs。CBFAN3署NCs．CBFAN4)，其转录激活活性仍然很明显。j一{。“毒糕|图3-3Cs．CBF核定位Fig．3-3nuclearlocalizationoftheCs—CBFgeneproduct3．3．3B一半乳糖苷酶活性测定为了进一步确定转录激活活性核心区域，我们以ONPG为底物测定了含有重组子的酵母的B．半乳糖苷酶活性。结果显示：虽然都含有完整的C米端，但是Cs．CBF△N1的活性明显比Cs．CBF和Cs．CBF△N高，因此，推测N术端$tIAP2结构域36 信刚师范学院硕十学位论文可能对Cs．CBF的转录激活活性起阻碍作用。与全长蛋白相比，Cs．CBF旧}拍9(Cs—CBFAN3)：币lJCs—CBF引争259(Cs．CBF△N4)突变蛋白仍有棚同甚至更高的B．半乳糖：舒活性。若去除C术端区域端部的68个氨基酸，其转录激活活性消失。因此，Cs—CBF的C术端68个氨基酸残基在转录激活功能中起着关键作用P然而，它的更精细作用还有待研究。CgCgFf1-259)CsCBFAC(I一74)CsCBFACl(I—136)CsCBF△N△Cl(74-136)CsCBFAN(74—259)CsCBF△Nl(J37-259)CsC贸△Ni△C2(137一174)CsC即△N1△C3(137-19I)CsCBF△N2△C4(172-220)CsCBF△N3fl92-259)CsCBF△N4(215—259)[=：二二=卜——————————————————_卜———～⋯——————吒=========二]卜_——————————————————C二：二]一图3—4GAL4DNA结合结构域与符种Cs．CBF缺火突变形成的融合蛋白概要图Fig．3-4SchematicoverviewofthefusionproteinsformedbetweentheGAL4DNA—bindingdomainandvariousdeletionmutantsofCs-CBFthatweretestedfortranscriptionactivatingactivityinyeastA：SD／-Trp／-His／．AdeB：SD／-Trp图3—5Cs．CBF基冈及各种缺火突变GALA结合结构域融合及转化A：筛选具有转录激活活件的重组了：B：筛选蓖纽了。Fig．3-5TheCs-CBFgeneanditsdeletionconstructswerefusedin．frametotheGAL4DBexpressionvectorandthentransformedintoyeast．A：Theexistenceortranscriptionalactivationactivitywasconfirmedbygrowthon—Trp，·Hisand-AdeS)’ntheticmedium．B：Thetransformantswereselectedbygrowthon—Trpsyntheticmedium．37 信圈1师范学院硕+学位论文图3—6以ONPG为底物检测含有重组子的酵母的p-小乳糖萤酶活性奉实验霞复3次，取’I，均值士标准洪。Fig．3-613-galactosidaseenzymeactivitieswerequantifiedusingONPGassubstrateaftergrowthofyeastinliquidculture．Thisassaywasrepeatedthreetimeswithindependentclones．Thevaluesaremeans士SD．3．4讨论无外源物质的情况下，GFP蛋白在单一长波紫外或蓝光光源激发下，可在活细胞中发出绿色荧光，且荧光性质稳定，对细胞无毒性，被誉为活细胞探针。利用基因工程技术，将GFP基因与目的基因融合使其表达融合蛋白，且在融合蛋白中GFP的荧光特性和外源蛋白的构象及功能一般不受影响，应用荧光显微镜可方便地检测到外源蛋白质在细胞内的表达、迁移及定位情况。氨基酸序列分析发现，Cs．CBF的N术端附近有一段保守氨基酸序列PKKRGGRKKVK，该序列的同源序列起着核定位信号的作用，本实验中我们将茶树的CBF基因与GFP基因融合，农杆菌介导在洋葱细胞中瞬时表达，结果显示融合蛋白定位在洋葱表皮细胞的细胞核中，通过生物信息学分析以及亚细胞定位实验，我们得出结论Cs．COR基因属于CBF家族成口贝。通过同源比对(图2．3)，我们发现茶树CBF中含有AP2保守区域，但与其他植物中CBF的C端几乎无同源性，根据其丰富的酸性氨基酸含量推测它在CBF转录因子中可能起着转录激活的功能。通过酵母双杂交实验我们确定Cs．CBF具有转录激活活性，且其转录激活活性存在与C末端区域，核心区域是端部的68个氨基酸残基，而C木端区域以外结构没有转录激活活性，甚至对该功能起着阻碍作用。一《《尹∥一陶圈圈^≯，一点拗k黟鹃∥ 信5119币范学院硕十学何论文转录因子的结合结构域非常保守，而激活结构域高度可变，可能与DNA与蛋白质的性质有关，结合结构域与DNA相互作用，合成DNA的核营酸种类只有四种，构象形式少，因此较稳定。激活结构域与蛋白质相互作用，而蛋白质的构象千变力-化，相应的不同物种中与之作用的结构差异也较大，甚至在同一物种中，不同的CBF家族成员的激活结构域也有较大差别。39 信刚师范学院硕十学位论文第4章转基因烟草中表达载体pBll21一CsCBF的构建随着植物分子生物学的发展，基因工程技术为农作物选择育种提供了新途径，它通过转基因手段可以定向地向作物导入外源目的基因，可控性与针对性强、所需时间短、效果显著，在一些多年生植物的抗性育种上具有很大优势【82】。转基因拟南芥中过量表达CBFl或CBF3基因，能够使启动子中含有CRT／DRE序列的基因，如CORl5a，COR78等表达，转入CBFI或CBF3基因的植株其抗寒性要比正常植株高。在前几章中，我们研究了Cs．CBF的详细结构、生化性质和表达模式，当茶树受到低温胁迫时，Cs．CBF基因转录产物迅速积累，基于Cs．CBFAP2结构域保守的第14位缬氨酸和第19位谷氨酸残基和术端DSAW四肽序列识别标志以及N木端区域附近保守的核定位序列，Cs．CBF被看作是CBF家族的成员。尽管我们已经确定该基因受到冷胁迫诱导，但该基因是否在茶树抗冷胁迫中起到生物作用仍是一个问题。为了解决这个问题，我们期望将Cs．CBF基因转入烟草中，从而研究该基因在生物体内的调控模式以及该基因对植物抗寒性的作用。本章主要构建了转基因烟草表达载体pBll21．CsCBF。在该过程中，我们希望Cs．CBF基因取代pBll21载体中的GUS基因，但是由于GUS基因的切除必须用到SacI内切酶，而Cs．CBF基因中含有SacI酶切位点，因此Cs．CBF基因不能直接取代GUS基因。我们首先酶切pBll21载体中的NOSterm片段，将其连接到pUCl8载体上，然后将Cs—CBF基因与pUCl8载体上的NOSterm定向连接，最后将CsCBF-NOS一起置于pBll21载体的35S启动子之后，取代GUS．NOS。4．1试验材料4．1．1菌株和质粒菌株：大肠杆菌DH5a，农杆菌EHAl05。质粒：pUCl8，pBll21。4。1．2试剂和试剂盒纯化试剂盒，质粒提取试剂盒，连接试剂盒，XbaI酶，EcoRI酶，SacI(购自TaKaRa公司)，KpnI(购自TaKaRa公司)。 信刚师范!学院硕十学能论文熏聚蒜延磐图4·1pUCl8和pBll21限制性图谱Fig．4-1restrictionMapofpUCl8andpBll214．2试验方法4．2．1pBI121载体中的NOS片段重组到pUCl8载体中(1)5coRI内切酶和SacI内切酶双酶切pUCl8和pBll21载体EcoRI内切酶分别酶切pUCl8和pBll21载体，反应体系如表4．1：表4．1酶切反麻体系Table4·1Reactionsystemofdigestion反应成分reactioningredient体积volume(I．t1)ddH2010×HBu仃．er质粒EcoRI酶33510237"(2反应3~4h，电泳检测是否完全酶切，SacI内切酶酶切EcoRI酶切的纯化产物，41完全酶切后，用纯化试剂盒纯化。反应体系如表4．2： 信|；I1师范学院硕十学{!i》=论文表4-2酶切反虑体系Table4-2Reactionsystemofdigestion反应成分reactioningredient体积volume(p1)ddH2010×LBufferEcoRI酶切纯化产物Sacl酶13530237"C反应3~4h，纯化试剂盒纯化。(2)用solutionI连接酶连接酶切产物，连接体系如表4—3：表4-3连接反应体系Table4-3Reactionsystemofligations反应成分reactioningredient体积volume(p1)ddH20舣酶切的pUCl8纯化产物舣酶切的pBll21纯化产物solution10．5O．54516℃反应过夜。(3)连接产物转化到大肠杆菌DH5a感受态细胞中，转化方法见2．2．2，进行蓝白斑筛选。(4)分别挑取培养基平板上几个白色单菌落，置于5ml的LB液体培养基(含Ampl00mg／m1)中，37。C，200rpm摇床培养过夜，用质粒提取试剂盒提取质粒。(5)电泳及双酶切(见步骤l和2)鉴定重组质粒。4．2．2铅一饼基因重组到含有NOS的pUOl8载体中(1)Cs．CBF基因的扩增为了使Cs．CBF基因与重组到pUCl8载体上中NOS同方向融合，且基因的编码序列不发生改变，我们设计引物，在基因的5’端引入XbaI酶切位点，在3’端引入却刀I酶切位点，进行定向插入，引物序列如下：178lefi-XbaI：5'-ggtctagaatggattcgagcaagaaaaa一3’178right一印力I：5'-ggggtaccttaaattgagaagctccaga一3’42 信刚师范学院硕十学位论文PCR反应体系10xbuffer8111，dNTP(2．5mM)6．4rtl，引物l(10“M)4pl，引物2(10taM)4“l，模板(插入Cs-CBF全长序列的pMDl8重组质粒)l111，TaqDNA酶1pl，加ddH20至80“l。PCR条件：94"C2min，94"(230s，52。C30s，72℃lmin：30个循环。电泳检测，用纯化试剂盒纯化PCR产物。(2)Cs．CBFPCR产物双酶切’先用KpnI酶酶切Cs．CBFPCR产物，反应体系如表4．4：表4-4酶切反应体系Table4-4Reactionsystemofdigestion反麻成分reactioningredient体积volume(p!)ddH2010×LBufferPCR产物KmI酶18525237℃反应3~4h，完全酶切后，用纯化试剂盒纯化。再用XbaI进行酶切，反应体系如表4．5：表4-5酶切反应体系Table4-5Reactionsystemofdigestion反麻成分reactioningredient体积volume(p1)ddH2010×TangoTMBufferKpni酶切产物XbaI酶28515237℃反应3~4h，纯化试剂盒纯化。(3)pUCl8．NOS重组质粒KpnI和XbaI双酶切，方法同步骤2。(4)用纯化试剂盒分别纯化双酶切产物Cs．CBF和pUCl8．NOS，然后用solutionI连接，方法同4．2．1中步骤3。(5)转化到大肠杆菌DH5a感受态细胞中，转化方法见2．2．2，进行蓝白斑筛选。(6)挑白色菌落液体培养，提取质粒，PCR法鉴定pUCl8．CsCBF．NOS。43 信刚师范学院硕十学位论文4．2．3CsCBF—NOS重组到pBll21载体中(1)用EcoRI和XbaI双酶切鉴定正确的pUCl8-CsCBF．NOS重组质粒和pBll21载体，方法同4．2．2中步骤2。(2)用AgaroscGelDNApurification试剂盒回收pl§1121载体大片段。(3)solutionI酶连接。(4)转化到大肠杆菌DH5a感受态细胞中，转化方法见2．2．2。(5)随机挑取菌落液体培养，提取质粒，PCR法鉴定，并进行测序。4．3结果与分析4．3．1pBll21质粒中的NOS片段插入到pUtl8载体的多克隆位点用EcoRI和SacI将pBll21质粒中的NOS片段切下，由于EcoRI和SacI的反应缓冲液不同，所以两种酶不能同时作用，只能依次进行单酶切。电泳检测酶切产物，观察到一条大条带，根据位置判断为pBll21质粒，NOS片段与pBll21质粒相比，条带非常小，因此不能在电泳图中显示出来。pBll21质粒酶切产物与pUCl8载体连接后，转化筛选。由于pBll21质粒具有Kan抗性，而pUCl8为Amp抗性，因此，通过加有Amp的LB培养基和蓝白斑筛选，可以筛选出含pUCl8片段的重组质粒。挑取6个白色菌落，液体培养提质粒，。电泳检测质粒的大小，进行初步判断，然后再进行EcoRI和SacI酶切，电泳结果显示有4个质粒有两条带，一条大小与pUCl8相同，另一条大小与NOS相同，说明这些质粒为pUCl8和NOS重组质粒，图4．2显示了NOS在pUCl8载体中的位置。ab幽4-2NOS片段插入剑pUCl8载体a：pUCl8载体的多克降位点序列，部分晦切位点朱标jII。b；NOS4：pUCl8中的位置。Fig．4-2NOSfragmentinsertspUCI8vectora：MultiplecloningsitesofpUCl8．．somerestrictionsitesarcnotshown．b：thepositionofNOSfragment． 信圈1师范学院硕十学位论文4．3．2Cs-CBF基因与pUtl8-NOS重组载体中的NOS连接在pUCl8载体中，KpnI酶切位点紧邻SacI酶切位点，我们在Cs．CBF基因的3’端引入KpnI酶切位点，同时在5’端引入XbaI酶切位点，将Cs．CBF基因插入到pUCl8-NOS中，位茕如图4．3所示。Cs-CBF基因与NOS之间相隔两个酶切位点，为了不使Cs．CBF基因的3’端编码序列发生改变，插入的Cs．CBF基因带有终止密码子。通过加有Amp的LB培养基培养筛选，挑取6个菌落液体培养提质粒，用GSPl／GSP2和Fulllength，1／Fulllength．2(引物序列见表1．1)两对引物分别对6个质粒进行PCR检测，其中，2个质粒的PCR产物大小正确，判定为正确的pUCl8-CsCBF．NOS重组质粒。图4-3Cs．CBF基冈插入到pUCl8-NOS载体中Fig．4-3Cs—CBFgeneinsertspUC18vector4．3．3CsCBF-NOS与pBll21载体的35S启动子连接用EcoRI和XbaI将CsCBF-NOS作为整体从pUCl8中切下来，同时将pBll21质粒中的GUS．NOS切下，回收pBll21质粒大片段，连接CsCBF．NOS和pBll21，CsCBF．NOS在pBll21中的位置如图4．4。通过含有Kan的LB培养基筛选，挑取6个菌落液体培养提质粒，用GSPl／GSP2和Fulllength一1／Fulllength一2(引物序列见表卜1)两对引物分别对6个质粒进行PCR检测，其中，3个质粒的PCR产物大小正确，挑选一个测序，结果jF确，保存，用于烟草转化。45 信圈1师范学院硕士学{}7：论文ab耐刮NPTIINOS卜阿，刊GUSNOSyPmlXb蚰EcoRI图4-4CsCBF-NOS插入剑pBll21中a：pBll21部分序列。b：CsCBF．NOS置换GUS．NOS。Fig．4-4CsCBF·NOSinsertspBI121vectora：partialsequenceofpBll21veclor．b：CsCBF-NOSreplacesGUS-NOSofpBll21vector．4．4讨论T-border(1eft)载体构建是烟草遗传转化中的关键，构建载体常用的方法是内切酶消化和连接酶连接，本实验选择表达载体PBll21作为基础表达载体，旨在用Cs—CBF基因取代pBll21载体(图谱见图4．1)中位于35S启动子调控之下的GUS基因，构建表达载体pBll21．CsCBF。pBll21载体中G珊基因的去除必须用到SacI内切酶，这就为Cs—CBF基因的连接造成了难题，因为Cs．CBF基因编码序列内存在SacI酶切位点。为了克服这个问题，我们设计了两个方法，一种方法是对Cs，CBF基因做部分酶切，但由于实验中酶切时间与酶切量等很难掌控，最终效果不理想。另一种方法是避丌SacI酶切位点，我们选择pUCl8载体作为中间过渡载体，因为该载体上含有多个酶切位点，且载体小易于操作。我们先将GUS基因后面的NOS终止序列和Cs．CBF基因分别插入到pUCl8载体(图谱见图4．1)的多克隆位点，使它们按照同一方向融合，最后把它们作为整体从pUCl8载体上切下，并取代pBll21载体的GUS-NOS。通过这种方法，我们最终成功构建了pBll21．CsCBF表达载体。 信掰f师范学院硕+学位论文第5章结论本研究以两年尘茶树幼叶为材料，克隆了一个编码CBF转录因子的Cs．CBF基因，利用生物信息学方法对该基因及其编码的氨基酸序列进行了结构分析和功能预测，分析了46C低温处理不同时长下该基因的表达模式，同时，确定了该基因编码的蛋白质在细胞内的位置及功能。最后，我们构建了转基凶烟草表达载体，为烟草转化实验做准备，以此探讨Cs—CBF基因表达水平与低温应答机制之间的相关性以及该基因提高茶树抗寒性中的作用。我们研究的主要结果如下：(1)在我们以前研究的基础上，利用RACE和RT-PCR方法，从茶树幼叶中分离克隆到一个编码CBF转录因子的基因eDNA全长序列，GenBank登录号为EU563238．1，该序列包含一个长780bp的ORF，编码一个由259个氨基酸残基组成的多肽链。预测分子量为28．199kDa，等电点pI5．15。(2)茶树CBF氨基酸序列与拟南芥、辣椒、甘薯和橡胶树CBF氨基酸序列进行同源比较表明，它们有较高的相似性，约在60％左右，而AP2结合结构域有非常高的同源性。氨基酸序列分析表明CsCBF蛋白含有一个保守的AP2结合结构域和～个非常不保守的C末端酸性结构域，同时含有两段CBF特有的多肽序列DSAW和PKK／RPAGR}(KFxETRHP。(3)Cs．CBF基因受低温诱导，未经低温处理的茶树幼苗的叶片中几乎检测不到Cs．CBF基因的表达，而经4℃低温处理后，该基因表达量在短时间内迅速升高，2h后开始下降，并在36h后几乎恢复正常。(4)Cs．C召聪因与GFP基因融合，构建pBll21表达载体，农杆菌介导转入洋葱表皮细胞，35S启动子作用下融合蛋白出现在细胞核中，说明Cs．CBF蛋白定位在细胞核中，且该序列的活性不需要翻译后修饰。(5)通过酵母杂交实验发现，Cs．CBF在酵母中起着反式激活作用，而且N端缺失并不影响这种激活活性，甚至还使C端具有更强的激活活性，对C端进一步进行缺失突变发现，这种激活活性存在于C米端端部的68个氨基酸中。(6)为了从生理水平进一步确定o．Cj9膳因的表达与植物体内的冷诱导基因的相关性及其在抗寒方面的作用，我们期望将o．d妒基因转入烟草中。为了构建表达载体pBll21．CsCBF，我们首先将o．d妒基因与pBll21的NOS终止序列在pUCl8载体中融合，然后将它们一起插入至JJpBll21载体中，烟草转化工作目前J下在进行中。47 信刚师范学院硕十学位论文致谢本论文是在导师袁红雨教授的悉心指导下完成的。三年中，我取得的每一点进步无不包含着导师酣心细心地培育，袁老师严谨的治学态度和渊博的学识令我受益匪浅，同时他谦虚和善的品行和孜孜不倦的敬业精神，更令我深深敬仰。在此，谨向我最尊敬的导卿致以最衷心地感酣!七年时光悄然而逝，毕业在即，心中感慨万千汇成一份浓浓的感激。感i身十生命科学学院所有领导和老师!特别感嘲李先文老师，谢素霞老师，冯志国老师，陈坤老师，卢东升老师，张苏锋老师，杨桂芳老师，刘慧娟老师，赵听梅老师，谢谢你们在学习和生活中的指导和关怀!感谢师兄师姐王磊，杨会敏，乔金莲，师弟师妹曾威，李向阳，王艳飞，刘颖，郝孟，谢谢你们在实验和生活中的热情帮助!感谢好友贾晓三年来苦乐相伴!感谢张娅婷师姐，朱涛师姐，好友李飞在生活中的帮助!．向所有关心我的各位老师和朋友致以深深地谢意!最后，感谢永远牵挂我无私支持我的父母和关心我的亲人，我的学业中包含着你们的辛劳，在你们关爱的目光中，我会更加努力，取得更加优异的成绩报答你们148朱小佩二零一一年四月 信阳师范学院硕十学位论文参考文献【l】GuyLC，NiemiKJ，BramblR．Alteredgeneexpressionduringcoldacclimationofspinach[J1．ProcNatlAcadSciUSA，1985，82：3673．3677．【2】LyousJM．Chillinginjuryinplants[J]．AnnRevPlantPhysiol，1993，24：445—528．【3】GuyCL．ColdacclimationandfreezingstresstoleranceroleofProteinmetabolism[J]．AnnuRevPlantPhysiolPlantMolBiol，l990，4l：187-223．【4】SteponkusPL．Membranedestabilizationduringfreeze—induceddehydration[J]．CurttopicsPlantPhysiol，1993，10：37—47．【5】ThomashowMF．Roleofcoid—responsivegenesinplantfreezingtolerance[J]．PlantPhysiol，1998，118：1．8．【6】WebbMS，UemuraM，SteponkusPL．Acomparisonoffreezinginjuryinoatandrye：twocerealsattheextremesoffreezingtolerance【j】．PlantPhysiol，1994，104：467—478．【7】UemuraM，JosephRA，SteponkusPL．ColdacclimationofArabiopsisthaliana(Effectonplasmamembranelipidcompositionandfreeze—inducedlesions)【J】．PlantPhysiol，1995，109：15—30．【8】LevittJ．Responsesofplantstoenvironmentalstresses[M]．NewYork：AcademicPress。1980．【9】CyrilJ，PowellGL，DuncanRR，eta1．Changesinmembranepolarlipidfattyacidsofseashorepaspaluminresponsetolowtemperatureexposure[J]．CropSci，2002，42：2031—2037．【10】干凭青，吴明生，千远亮，等．植物抗寒基冈jl：程研究最新进展【J】．重庆人学学报，2003，26(7)：81—85．【l1]VighL，LosDA，HorvfithI，eta1．Theprimarysignalinthebiologicalperceptionoftemperature：Pd‘catalyzedhydrogenationofmembraneliquidstheexpressionofthedesAgeneinSynechocystiePCC6803[．I]．ProcNatlAcadSciUSA，1993，90：9090．9094．【12]LosDA，RayMK，MurataN．Differencesinthecontrolofthetemperature—dependentexpressionoffourgenesfordesaturasesinSynechocystissp．PCC6803[J]．MolMicrobiol，1997，25(6)：l167—1175．【13]BrowseJ，XinZ．Temperaturesensingandcoldacclimation[J]．CurtOpinPlantBiol，2001，4(3)：241．246．【14]MurataN，Ishizaki-NishizawaO，HigashiS，eta1．Geneticallyengineeredalterationinthechillingsensitivityof#ants[J]．Nature，1992，356：710-713．【15】陈新建，陈·‘i宽，刘国顺，等．植物对水分胁迫响应的分子机制与抗逆基冈：I：程的研究进展【J】．热带弧热带植物学报，2000，8(1)：81．90．【16】赵福庚，刘友良．胁迫条件‘卜．高等植物体内脯氨酸代谢及凋17的研究进展[J】．植物学通报，1999，16(5)：9-16．49 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信Igllqili范学院硕十学位论文【61]GongZ，DongCH，LeeH，eta1．ADEADboxRNAhelicaseisessentialformRNAexportandimportantfordevelopmentandstressresponsesinArabidopsis[J]．PlantCell，2005，l7(1)：256-267．【62]YangTW：ZhangLJ，ZhangTGeta1．Transcriptionalregulationnetworkofcold-responsivegenesinhigherplants【J】．Plant'Sci，2005，169(6)：987-995．【62]OrverBL，SangwanV，OmannF，eta1．Earlystepsincoldsensingbyplantcells：theroleofactincytoskeletonandmembranefluidity[J]．PlantJ，2000，23：785-794．【64]XiongL，lshitaniM，LeeH，eta1．TheArabidopsisLOS5／ABA3locusencodesamolybdenumcofactorsulfuraseandmodulatescoldstress-andosmoticstress—responsivegeneexpression[J]．PlantCell，2001，l3(9)：2063-2083．【65]XiongL，LeeH，HuangR，eta1．AsingleaminoacidsubstitutionintheArabidopsisFIERYI／HOS2proteinconferscoldsignalingspecificityandlithiumtolerance[J]．PlantJ，2004，40(4)：536—545．【66]NakagamiH，PitzschkeA，HirtH．EmergingMAPkinasepathwaysinplantstresssignalling[J]．TrendsPlantSci，2005，10：339·346．【67]StockingerEJ，GilmourSJ，ThomashowMF．ArabidopsisthaHanaCBFIencodesanAP2domain·containingtranscriptionactivatorthatbindstotheC—repeat／DRE，acis—actingDNAregulatoryelementthatstimulatestranscriptioninresponsetolowtemperatureandwaterdeficit[J]．ProcNatlAcadSciUSA，1997，94(3)：1035-1040．【68]GilmourSJ，ZarkaDGStockingerEJ，eta1．LowtemperatureregulationoftheArabidopsisCBFfamilyofAP2transcriptionalactivatorsaSallearlystepincold·inducedCORgeneexpression[J]．PlantJ，1998，16：433-442．‘[69]LiuQ，KasugaM，SakumaYeta1．Twotranscriptionfactors，DREB1andDREB2，withanEREBP／AP2DNAbindingdomainseparatetwocellularsignaltransductionpathwaysindrought-andlow-temperature-responsivegeneexpression，respectively,inArabidopsis[J]．PlantCell，1998，10：139l-1406．【70]HaakeVCookD，RiechmannJL’eta1．TranscriptionfactorCBF4isaregulatorofdroughtadaptationinArabidopsis[J]．PlantPhysiol，2002，130(10)：639—648．【71]SakumaY，LiuQ，DubouzetJG，eta1．DNAbindingspecificityoftheERF／AP2domainofArabidopsisDREBstranscriptionfactorsinvolvedindehydrationandcold-induciblegeneexpression[J]．BiochemBiophysResCommun，2002，290(3)：998—1009．【72]MedinaJ，BarguesM，TerolJ，eta1．TheArabidopsisCBFgenefamilyiscomposedofthreegenesencodingAP2domaincontainingproteinswhoseexpressionisregulatedbylowtemperaturebutnotbyabscisicacidordehydration[J]．PlantPhysiol，1999，ll9：463—468．【73]RiechmannJL，MeyerowitzEM．TheAP2／EREBPfamilyofplanttranscriptionfactors[J]．BiolChem。l998。379(6)：633—646．53