山葡萄转录因子cbf1基因克隆和其遗传转化体系

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1、山葡萄转录因子CBF1基因克隆和其遗传转化体系摘要：根据山葡萄的CBF1基因序列设计一对特异引物，克隆出山葡萄(Vitisamurensis)栽培品种‘双优’的抗寒转录因子CBF1基因，并将其构建到pBI121表迖载体中，获得山葡萄转录因子CBF1基因的植物表达载体，命名为pBI121-ViCBFl,利用农杆菌介导叶盘转化‘巨峰’葡萄以研究高效的‘巨峰’葡萄转化体系。结果表明，以农杆菌LBA4404为介导菌株，以‘巨峰’葡萄叶片为外植体、3d为预培养时间和4〜5d共培养时间、4⑻mg•L-1羧节青霉素，50mg•L-1卡那霉素筛选浓度转化效果较好，并已筛选到6

2、株转基因植株，PCR检测均为阳性，为提高‘巨峰’葡萄的抗寒性建立了初步的技术基础。关键词：山葡萄；表迗载体；转录因子；遗传转化中图分类号：S663.1文献标识码：AD0I编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2014.02.002CloningofTranscriptionFactorCBF1ofVitisamurensisandItsSystemofGeneticTransformationLIUYang(ChangchunVocationalUniversity,Changchun,Jilin130033，China)Abstract：D

3、esigningapairofsingleprimerbyCBF1geneofVitisamurensis,cloningtranscriptionfactorCBF1geneofVitisamurensis，thevectorofpBI121-ViCBFlwasconstructedandtransformedtoVitislabruscanaKyohobyagrobacterium-mediatedmethod.Theregeneratedresistantplantscouldbeobtainedbypre-culturingfor3d,cocultur

4、ingwithAgrobacteriumtumefaciensLBA4404for4〜5d，andthentransferredtothecallusinducementmediacontaining400mg•L_1Carband50mg•L~1Kanfor28d.Underthisconstruction,therateofplanttransformationwasrelativelyhigherandsixputativetransgenicplantshadgotten,productofPCRwaspositive,thesystemwasanel

5、ementarytechnologyforincreasingcoldresistanceofVitislabruscanaKyoho.Keywords：Vitisamurensis；expressionvector；transcriptionfactor；genetictransformation当前，随着农业生态环境的不断恶化，低温、干旱及高盐严重威胁着现代化农业的发展。我国东北和西北两地农作物冻害发生普遍，因冻害所造成的损失也十分严重。我国东北山葡萄抗寒性最强（耐-40°（3低温），在山葡萄中发现的CBF低温反应途径是，通过CBF转录因子调控大量下游有C

6、RT/DRE(C-repeat/dehydrationresponsiveelement)调控元件的COR(cold-regulated)基因的表达，来提高植物的抗冻力［1-2］。据报道，大量表迖拟南芥CBF1基因的转基因植物，其抗寒性平均提高了10.8°C［3］。因此，大量表达抗寒功能更强的山葡萄CBF1基因的‘巨峰’葡萄，其抗寒能力很可能强于转拟南芥CBF1基因的植株，这种转基因‘巨峰’葡萄将能在东北乃至更寒冷的地区露地安全越冬，从而改变传统的“埋土防寒”措施，减少作物因低温天气造成的减产，具有广阔的应用前景。1材料和方法1.1材料山葡萄(Vitisamu

7、rensisRupr.)栽培品种‘双优’、‘巨峰’葡萄(VitislabruscanaKyoho)、大肠杆菌E.coliDH5a、农杆菌LBA4404感受态细胞、表达质粒pBI121均由吉林农业大学生命科学院提供。克隆载体为pGEM-Teasyvector购自宝生物工程(大连)有限公司。TaqDNA聚合酶、限制性内切酶T4DNA连接酶购自上海生工生物工程公司。DNA提取试剂盒、及切胶回收试剂盒均购自宝泰克公司。1.2山葡萄CBH基因的克隆根据已知的山葡萄CBF1基因序列设计引物，在其上游、下游分别引入XbaI、SacI酶切位点，上游引物：5"-CCATCTAG

8、ACCATGGACTCGGACCACG