烟草中nac类转录因子基因克隆和分析

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1、摘要烟碱是烟草根系合成的次生代谢产物，是烟草特有的生物碱。打顶以后，烟株体内烟碱含量大量积累，然而对造成烟株体内烟碱含量升高的原因以及烟碱合成的调节机制并不清楚。打顶前后烟碱合成能力的巨大差异，是用来研究调控烟碱合成分子机制的最佳时期，通过筛选烟株打顶前、后根尖组织的差异表达的基因将有新的发现。植物中含有大量的转录因子基因，在调控植物生长发育和逆境胁迫应答中起重要作用。常见的转录因子家族有AP2／EREBP、bZIP、MYB、WRKY和NAC等。本研究以本实验室构建的SSH．eDNA文库中筛选出的NAC类转录因子EsT序列为探针，电子克隆得到Ⅳf妣4C．RJ全长eDNA

2、序列，对于研究调控烟碱生物合成的分子机制有重要意义。本实验主要结果如下：(1)荧光定量PCR验证SSH．eDNA文库差异基因EST序列打顶前后的表达模式，F-box、MYB、NAC、8AHH,s刀在打顶24h后表达水平上升，WRKY,AUXIN—inducedmRNA在打顶24h后表达水平下降。(2)采用电子克隆和RT-PCR从烟草根尖组织克隆到NtNAC-R1。烟草NtNAC-R1开放性阅读框架长度为936bp，编码3l1个氨基酸，具有NAC转录因子家族典型的保守结构域。(3)组织特异性分析表明NtNAC—R1基因在根系中具有高水平表达。RT-PCR和Northern

3、杂交对烟草打顶前、后根尖组织中NtNAC-R1的表达模式分析表明该基因在烟株打顶后2—4h表达水平下降，随后上升。(4)构建了重组表达载体pRSETB-NtNAC-R1，转化表达菌株大肠杆菌BL2l系列菌株，成功表达目的蛋白，且目的蛋白以包涵体形式存在。(5)构建了NtNAC-R1基因的过量表达和反义抑制植物遗传转化载体，得到了该基因的反义抑制转基因植株。RT．PCR分析反义抑制转基因植株中烟碱合成相关基因PMT、ODC的表达模式表明这两个基因表达量下降。关键词：烟草；NAC类转录因子；基因克隆；表达AbstractThenicotineisasecondarymeta

4、bolitesynthesizedintheroot，atobacco-specificalkaloid．Aftertopping，thecontentofnicotineaccumulated，butthereasonwhythecontentincreasedandtheregulationmechanismofnicotinearenotclear．Therefore，suppressionsubtractivehybridizationwasadaptedtoconstructaeDNAlibraryofroottipbeforeandaftertoppinga

5、ndscreendifferentiallyexpressedgenes，whichhasgreatpotentialtorevealthemolecularbasisreferredtotheimpactoftoppingonthenicotinecontent．Therearealargenumberoftranscriptionfactorgenesinplantandtheyplayallimportantroleinregulatingplantdevelopmentandstressresponse．AP2／EREBP、bZIP、MYB、WRKY和NACar

6、ecommontranscriptionfactorsfamily．Inthisstudy,NACtranscriptionfactorESTsequenceswasscreenedoutfromSSH．cDNAlibraryanditwasasaprobestoclonethefull-lengtheDNAsequencesofNtNAC-R1．Ithadanimportantsignificanceonthestudyofmolecularmechanismsinregulationofnicotinebiosynthesis．Themainresultsareas

7、follow：(1)Real-timePCRtechniquewasappliedtoverifyexpressionpatternsbeforeandaftertoppingofESTsequencesofdifferentgene．ItshowedthatF-box、MYB、NAC、SAHH,STlhadanincreasedexpressionlevelat24haftertopping，WRKY,AUXIN—inducedmRNAhadandecreasedexpressionlevelat24haftertopping．(2)T