藤县药用野生稻内生固氮菌分离与鉴定.pdf

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1、学校代码：10564学号：2013201512分类号：Q939密级：硕士士学学位位论论文文藤县药用野生稻内生固氮菌分离与鉴定胡文哲指导教师：谭志远教授学院名称：农学院专业名称：作物遗传育种答辩委员会主席：年海教授中国·广州2016年6月华南农业大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。

2、作者签名：胡文哲日期：2016-06-13学位论文提交同意书本学位论文符合国家和华南农业大学关于研究生学位论文的相关规定，达到学位授予要求，同意提交。导师签名：谭志远日期：2016-06-13学科带头人签名：王兰日期：2016-06-14摘要固氮菌资源的收集挖掘可以帮助微生物肥料的研究与开发，微生物肥料与化肥合理搭配还能提高化肥利用率，在保证作物产量的同时减少成本和污染。本研究以广西自治区梧州市藤县蒙江镇那塘村一处山洼的药用野生稻为研究材料，采用三种无氮培养基经平板划线分离法筛选内生固氮菌，通过乙炔还原法测定其固氮酶活性和同位素丰度法验

3、证固氮能力；利用IS-PCR(Insertionsequence-basedPCR)指纹图谱和SDS-PAGE全细胞蛋白电泳指纹图谱对获得的内生固氮菌进行聚类分析；对于各个类群的代表菌株，根据16SrRNA基因序列分析确定其分子系统发育关系；使用溶解透明圈法定性检测溶磷解硅能力；Salkowski比色法定量测其产生长素能力；钼锑抗比色法定量测其溶磷能力；2,4-二硝基苯肼比色法定量测其ACC脱氨酶活性；络天氰（CAS）法检测产铁载体。主要得出以下研究结果：（1）从供试材料中分离纯化获得34株内生固氮菌，其固氮酶活性介于5.0到1036.

4、7nmol/mLh之间。分离获得的菌株用IS-PCR指纹图谱和SDS-PAGE全细胞蛋白电泳指纹图谱可聚为5个类群，类群I和II各有8株，类群III、IV、V分别有215株、5株和11株。固氮酶活性最高的菌株HU31，同位素丰度法检测N同位素丰度达到25.15%，超过自然丰度0.36%。（2）各个类群代表菌株16SrRNA基因序列分析表明：类群I代表菌株HU33与T无乳固氮螺菌（AzospirillumamazonenseATCC35119）相似性为97.13%；类群II代T表菌株HU31与变栖克雷伯氏菌（Klebsiellavari

5、icolaDSM15968）相似性为99.71%；T类群III代表菌株HU17与蒙氏假单胞菌（PseudomonasmonteiliiATCC700476）相似T性为99.86%；类群IV代表菌株HU13与黄黄色杆菌（XanthobacterflavusATCC35867）相似性为100%；类群V代表菌株CM05与越南伯克霍尔德菌（BurkholderiaTvietnamiensisLMG10929）相似性为99.86%。（3）代表菌株HU31和CM05都可以溶磷脱硅；比色法定量测出菌株HU31和CM05的解磷能力分别为105.4±6.

6、9μg/mL和71.8±9.0μg/mL。代表菌株HU31、HU17和CM05有产铁载体能力。5个类群的代表菌株都具有产生长素能力，在有色氨酸存在的情况下，菌株HU13、HU17和HU31的产生长素能力显著高于没有色氨酸存在的时候，说明这三株内生菌生长素合成途径依赖色氨酸。5个类群代表菌株都具有ACC脱氨酶活性。I（4）代表菌株HU31在低氮液体培养情况下，使充满N2的密封塑料瓶凹陷。本研究分离筛选的野生稻内生固氮菌具有生物多样性，并且具有一定的农业生产应用潜力，为微生物肥料生产收集了菌种资源；类群I代表菌株HU33可能是一个新类群，有

7、待于DNA杂交和电子显微镜观察进一步验证；类群II代表菌株HU31在低氮液体培养情况下也能高效固氮，有可能代表一种新的固氮体系。关键词：野生稻；内生固氮菌；多样性分析；分子鉴定；特性研究IIIdentificationofEndophyticDiazotrophsIsolatedfromTengxianOryzaOfficinalisHuWenzhe(CollegeofAgriculture,SouthChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou510642,China)Abstract:Thecollec

8、tionanddiggingofnitrogenfixingbacteriaresourceswouldhelptothedevelopmentandresearchofmicrobialfertilize