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1、自生固氮菌的分离及鉴定芦庭秀(枣庄学院生命科学系山东枣庄277160)摘要：固氮菌(Azotobactersp.)是生物固氮的重要微生物资源，在自然界的氮素循环屮具冇重耍作用，可冇效捉高土壤的有效氮素，增加粮食产量。试验采用土粒撒播法，从枣庄学院生物园地菜园土壤中分离2株口生固氮菌，综合其形态学特征、生理生化特征将其初步鉴定为德克斯氏菌属(Derxiaspp.)o试验为研制开发新型牛物菌肥提供了菌种资源。关键词：口生固氮菌分离纯化鉴定微生物肥料农业生产不仅要求高产、稳产，而且要求品质优良。长期以來，为确保农产品高产丰收，人们大量使用化学农药化肥，使得生态环境每况愈下，十分不利于
2、农业可持续发展。生物肥料由于具有增加土壤生物多样性、改善农产品品质、能自我更新增殖和永续利用的特性，其发展备受关注。微生物肥料是指应用丁•植物或土壤环境屮冇生物活性，起肥料效用、或以肥料方法施用的，以微生物活性生物体或其代谢产物为主耍作用因了的生物制剂或肥料制品山。微生物肥料种类繁多，按照微生物的作用机理可分为根瘤菌肥料、自牛固氮菌肥料、解磷细菌肥料、解钾细菌肥料、抗牛菌肥料和复合微牛物肥料[2]o固氮菌可将空气中N2还原为可被作物吸收利用的NH4+,由于共生固氮菌具冇宿主专一性，所以应用范围窄，而自生固氮菌不受这些因素限制，固氮能力较强，还能产生眄I味乙酸等植物激素，刺激植物
3、生长，促进增产，其生产和使用很方便⑶。因此，试验将从农田土壤中分离得到自生固氮菌，为研究开发新型生物氮肥提供理论依据。1材料与方法1.1试验材料1丄1土样枣庄学院生物园地菜园土壤1.1.2培养基阿须贝培养基：葡萄糖10g,KH2PO40.2g,CaSO40.2g,NaCl0.2g,CaCO30.2g,MgSO40.2g,lOOOmL水，pH7.21.1.3主要仪器超净工作台，HD—650,苏州净化设备有限公司恒温培养箱，SHP—250,上海精宏实验设备有限公司微量移液枪，1000〜5000uL,上海雷勃分析仪器有限公司冰箱，BCD—2226,青岛海尔股份有限公司电子天平，JT2
4、01N,上海精天电子仪器冇限公司显微镜，N—180M,OhausCorp酒精灯，试管，培养皿，锥形瓶，糖瓷杯，玻璃棒，接种环，棉塞，标签，打火机，酒精棉球，试管架，照相机等。1.2试验方法1.2.2土样的采集选用未使用过农药和除草剂的枣庄学院生物园地，用五点取样法采集土样。先铲去地表土层2〜3cm,取3〜10cm深层土壤，装入无菌袋内，并记录取样地点、环境及日期。土样采集后带回实验室及时分离。1.2.1口生固氮菌的分离纯化将采得的土壤均匀的洒在阿须贝培养基上，在37°C恒温培养箱中培养1〜2d观察。待长出菌落后，对菌落特征进行观察、记录和编号，挑取少量菌体于无氮培养基平板上进行
5、多次划线分离获得纯培养。1.2.2菌株的鉴定1.22.1菌株形态特征观察⑷无氮培养基平板表面划线接种，37°C恒温培养1〜7d,观察菌落的颜色、形状和大小、透明度和粘度、边缘和隆起形状、表面光滑程度以及是否产生非水溶性色素等。对培养18〜24h的菌体进行染色，在光学显微镜卜-观察菌体形状、排列方式、有无芽孑包等个体形态特征，菌体革兰氏染色结果，并测定细胞大小。1.2.2.2菌株生理生化特征测定&习选用培养18〜24h的菌休分别进行淀粉水解试验、口引味试验、接触酶试验、甲基红试验、乙酸卬基卬醇试验、葡萄糖产酸试验，记录试验结果。2结果与分析2.1自生固氮菌的分离采用土粒撒播法从采
6、样农田十.壤中分离得到自生固氮菌。依据固体培养特征，初步判断分离得到2种自生固氮菌，编号为1号和2号。2.2固氮菌的菌种鉴定2.2.1形态特征利用阿须贝培养基，37°C培养24〜48h后，1号口生固氮菌呈不透明I员I形菌落，隆起粘稠，培养后期（5〜6d）呈浅黄色；2号菌呈水滴状菌落，透明粘稠,后呈堆状、不透明、具皱纹的高凸起（图1、2）。革兰氏染色后，显微镜观察个体形态，结果见表1。图1自牛•固氮菌48h培养特征图21号菌株后期培养特征表1革兰氏染色、菌落和菌体形态特征TablelProfileofcolonyshape,cellshapeandGramstaining菌株St
7、rain特征Characters1号菌落直径1〜2nun,不透明、边缘整齐、老菌浅黄色。G・,细胞呈现杆状，具圆端，0.9〜l.lumX1.0~3.0um,单个、成对、短链状排列2号菌落直径3~4mm,不透明、边缘整齐、老菌赤褐色。G・,细胞呈现杆状、具圆端，1.0〜1.3umX2.0〜3.2um,单个、成对、短链状排列2.2.2生理生化特征表2生理生化鉴定结果Table2PhysiologicalPhenotype特征Characters1号2号革兰氏染色GramstainingG・G-形
