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1、利用16SrRNA基因序列分析进行微生物分类鉴定【实验目的】1.了解微生物分子鉴定的原理和应用。2.掌握利用16SrRNA棊因进行微生物分了鉴定的操作方法。3.运用软件构建系统发冇树并对微生物进行系统发冇关系分析。【实验原理】长期以来，对微生物的分类鉴定主要采用分离培养、形态特征、生化反应和免疫学等方法。但这些传统手段均存在耗时长、特界性差、敏感度低等问题，难以满足现代细菌学研究的发展要求。随着分子生物学技术的迅速发展，特别是聚合酶链式反应（PCR）技术的出现及核酸研究技术的不断完善，产生了许多新
2、的分类方法，如质粒图谱、限制性片段长度多态性分析、PCR指纹图、rRNA基因（即rDNA）指纹图、16S核糖体核糖核酸（ribosomalRNA,rRNA）序列分析等。这些技术主耍是对细菌染色体或染色体外的DNA片段进行分析，从遗传进化的角度和分了水平进行细菌分类鉴定，从而使细菌分类更科学、更精确。其中原核生物16SrRNA基因（真核ISSrRNA基因）序列分析技术已被广泛应用于微生物分类鉴定。核糖体rRNA对所有生物的生存都是必不可少的。其小16SrRNA在细菌及其他微定物的进化过程中高度保守，
3、被称为细菌的“分子化石”。在16SrRNA分子中含有高度保守的序列区域和高度变化的序列区域，因此很适于对进化距离不同的各种生物亲缘关系的比较研究。其具体方法如下：首先借鉴恒定区的序列设计引物，将16SrRNA基因片段扩增出來，测序获得16SrRNA基因序列，再与生物信息数据库（如GenBank）中的16SrRNA基因序列进行比对和同源性分析比较，利用可变区序列的差异构建系统发育树，分析该微生物与其他微生物之间在分子进化过程中的系统发育关系（亲缘关系），从而达到对该微生物分类鉴定的冃的。通常认为，1
4、6SrRNA基因序列同源性小于97%,「”以认为属于不同的种，同源性小于93〜95%,町以认为属于不同的属。系统进化树（系统发冇树）是研究生物进化和系统分类中常用的-•种树状分枝图形，用來概括各种生物Z间的亲缘关系。通过比较生物人分子序列（核井酸或氨基酸序列）差异的数值构建的系统树称为分子系统树。系统树分有根树和无根树两种形式。无根树只是简单表示生物类群Z间的系统发育关系，并不反映进化途径。阳有根树不仅反映生物类群Z间的系统发育关系，而11反映出它们有共同的起源及进化方向。分子系统树是在进行序列测
5、定获得分子序列信息后，运用适当的软件由计算机根据各微生物分子序列的相似性或进化距离来构建的。计算分析系统发育相关性和构建系统树时，可以采川不同的方法如棊于距离的方法[UPGMA、ME（MinimumEvolution,最小进化法）]、NJ（Neighbor-Jioning,邻接法）、MP（MaximumParsimony,最大简约法）、ML（MaximumLikelihood,最人似然法）和贝叶斯（Bayesian）推断等方法。构建进化树需要做Bootstrap检验，一般Bootstrap值大于7
6、0,认为构建的进化树较为可靠。如果Bootstrap值过低，所构建的进化树的拓扑结构可能存在问题，进化树不可靠。一般采用两种不同方法构建进化树，如果所得进化树相似，说明结果较为可靠。常用构建进化树的软件有Phylip、Mega、PauP、T-REX等。木实验以枯草芽孑包杆菌的鉴定为例，应用16SrRNA基因序列分析技术进行微牛.物鉴定的实验。【实验用品与仪器】1•菌种和质粒（1）菌种：枯草芽抱杆菌，E.coliDH5（2）质粒：pMD18-T载体2.培养基LB培养基：胰蛋白丿冻10g,酵母提取物5
7、g,NaCl10g,蒸馅水IL,pH7.2。3.试剂和溶液琼脂糖、细菌基因组提取试剂盒、dNTP、DNA聚合酶、PCR产物纯化试剂盒、T4DNA连接酶、X-gakIPTG、限制性内切酶SpHI和PstI等。4.仪器设备及其他PCR仪、电泳仪、高速冷冻离心机、凝胶成像系统、超净工作台、摇床、电了天平、恒温培养箱等。【实验内容】1.设计合成引物使用16SrRNA全长通用引物。引物1：5-AGAGGTTGATCCTGGCTCAG■丁；引物2：5f-TAGGGTTACCTTGTTACGACTT-3fo提交
8、基因合成公司合成。2.PCR扩增16SrRNA基因片段以基因组DNA为模板，最适量为0.1〜1.0ng,过多可能引发非特异性扩增，过少可能扩增失败PCR体系一•般用25pL,使用保真度较髙的DNA聚合酶。反应体系:模板1
9、1L引物10.5
10、1L引物20.5pLdNTP(lOmM)0.5
11、liLTaq酶(5U/ml)0.5
12、_iLlOxPCRbuffer2.5pL火菌水至25gLPCR反应：94°C预变性5min,94°C变性30s,65°C退火40s,72°C延伸90s,30个循环
